نيو إنجلاند بيولابس، E3322S، مجموعة تركيب الحمض النووي الريبوزي المرشد EnGen®، المكورات العقدية المقيحة

مجموعة EnGen لتخليق الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA)، الفئات ذات الصلة : مواصفات تخليق الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) ، المواد المطلوبة (غير المرفقة ): أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي المستهدفة، جهاز تدوير حراري/كتلة تسخين 37 درجة مئوية/حاضنة، ماء خالٍ من النيوكلياز، معدات وكواشف لتحديد كمية الحمض النووي الريبوزي (RNA)، أعمدة طرد مركزي لتنقية الحمض النووي الريبوزي (مثل NEB #T2040)، أنابيب خالية من إنزيم RNase، رؤوس بخاخ، جهاز طرد مركزي دقيق. مواد اختيارية: فوسفاتاز قلوي، نيوكلياز Cas9 من أمعاء العجل (CIP)، إنزيم S. pyogenes EnGen Spy Cas9، هلامات NLS، محلول تشغيل، صبغة تحميل الهلام، سلالم الحمض النووي الريبوزي (RNA) والحمض النووي (DNA)، صندوق الهلام. الأسئلة الشائعة : س: هل من الضروري إضافة "G" إلى الأوليغونوكليوتيد بعد تسلسل محفز T7؟ ج: يلزم وجود G واحد على الأقل، مباشرة بعد "TATA" من تسلسل محفز T7، من أجل نسخ فعال. سيكون هذا G هو +1 للنسخة. إذا كان التسلسل المستهدف المحدد المكون من 20 نيوكليوتيدًا يحتوي على قاعدة غوانين (G) في الطرف 5'، فلا داعي لإضافة قاعدة غوانين أخرى، لأن قاعدة الغوانين الموجودة في التسلسل المستهدف ستؤدي وظيفة +1. س: هل من الضروري معالجة تفاعل تخليق الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) باستخدام إنزيم ديوكسي ريبونوكلياز (DNase)؟ ج: نوصي بمعالجة تفاعل تخليق الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) باستخدام 2 ميكرولتر من إنزيم ديوكسي ريبونوكلياز I (DNaseI) المرفق (خالٍ من إنزيم ريبونوكلياز) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، متبوعًا بتنقية باستخدام عمود طرد مركزي. ستؤدي إزالة قالب الحمض النووي (DNA) والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (NTPs) والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات المشتقة (dNTPs) المتبقية إلى قياس أكثر دقة لكمية الحمض النووي الريبوزي (RNA)، حيث أن الأجهزة التي تقرأ الامتصاص عند 260 نانومتر (مثل مطياف الأشعة فوق البنفسجية التقليدي أو جهاز NanoDrop™) ستقرأ كلاً من الحمض النووي الريبوزي (RNA) والحمض النووي (DNA) ولن تعطي تركيزًا دقيقًا. من المهم مراعاة كيفية تأثير قالب الحمض النووي (DNA) والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات المشتقة (dNTPs) والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (NTPs) المتبقية على التطبيقات اللاحقة. س: لماذا لا يُظهر جزيء sgRNA الخاص بي نشاط قطع Cas9 بنسبة 100% في المختبر؟ ج: نوصي باستخدام مواقع التنبؤ بالأهداف للمساعدة في تحديد التسلسلات المثلى لاستهداف الجينات باستخدام Cas9. يُرجى الرجوع إلى صفحة منتج Cas9 (NEB #M0386 أو NEB #M0641 (NLS)) للاطلاع على معلومات البروتوكول. للحصول على معلومات عامة حول تحرير الجينوم وتخطيط التجارب باستخدام منتجات NEB، يُرجى زيارة: https://www.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-biology/genome-editing س: هل من الضروري معالجة جزيئات sgRNA الخاصة بي بالفوسفاتاز؟ ج: تحتوي جزيئات RNA المنسوخة بواسطة بوليميراز العاثية على ثلاثي فوسفات في الطرف 5'. ستزيل معالجة الفوسفاتاز هذه الثلاثي الفوسفات، تاركةً مجموعة هيدروكسيل في الطرف 5'. في حال المعالجة بالفوسفاتاز، نوصي بالمعالجة بعد المعالجة بـ DNaseI. لا يمكن تعطيل الإنزيم بالحرارة، لذا يُعدّ استخلاص الفينول:الكلوروفورم الطريقة المُفضّلة لتعطيله. س: هل ستتعرّف نظائر Cas9 من كائنات حية مختلفة على جزيئات sgRNA المُصنّعة من هذه المجموعة (NEB #E3322S)؟ ج: لا. تحتوي جزيئات sgRNA المُصنّعة من هذه المجموعة على تسلسل tracrRNA الذي يتعرّف عليه Cas9 من المكورات العقدية المقيحة تحديدًا. س: هل أُضمّن PAM(NGG) في تسلسل sgRNA الخاص بي؟ ج: عند ارتباط Cas9 بجزيء sgRNA، يتكوّن مُركّب يُوجّه للارتباط بالحمض النووي المستهدف عند وجود موقع PAM(NGG) مُباشرةً بعد تسلسل الهدف المُكوّن من 20 نيوكليوتيدًا في الحمض النووي. يُشترط وجود PAM على السلسلة المستهدفة لكي يتعرّف مُركّب Cas9 على الحمض النووي ويرتبط به. وهو ليس جزءًا من تسلسل الحمض النووي الريبوزي الدليل، ولا ينبغي تضمينه في الأوليغونوكليوتيد عند تصميم جزيئات sgRNA. س: ما هو تسلسل الأوليغونوكليوتيد الضابط المرفق مع مجموعة EnGen sgRNA Synthesis Kit، S. pyogenes؟ ج: تسلسل الأوليغونوكليوتيد الضابط هو: 5' TTCTAATACGACTCACTATAGGCATCCTCGGCACCGTCACCCGTTTTAGAGCTAGA 3'. التسلسل النهائي لـ sgRNA الضابط المُصنّع باستخدام المجموعة هو: GGCAUCCUCGGCACCGUCACCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU. يستهدف sgRNA المُصنّع من الأوليغونوكليوتيد الضابط البلازميد pBR322 (NEB #N3033، القواعد 112-131). يمكن الاطلاع على تسلسل البلازميد الكامل هنا. يؤدي تحضين مركب sgRNA الضابط المرتبط بإنزيم Cas9 من بكتيريا S. pyogenes بوجود بلازميد pBR322 الخطي المُعالج بواسطة إنزيم PvuII كهدف (4361 زوجًا قاعديًا) إلى نواتج قطع بطول 2423 و1938 زوجًا قاعديًا (انظر الشكل 6، الدليل). بدلاً من ذلك، يمكن استخدام البلازميد غير المقطوع (المُلتف) كقالب. على هلام الأغاروز، بالمقارنة مع القالب غير المقطوع، سيتحرك البلازميد المقطوع بواسطة Cas9 بشكل أبطأ (أعلى) من البلازميد المُلتف. تسلسل الهدف لـ sgRNA الضابط هو: 5' CATCCTCGGCACCGTCACCC 3'. يقع هذا التسلسل ضمن جين tetR(C) على بلازميد pBR322، وقد يكون موجودًا في نواقل استنساخ أخرى، مع ضرورة التحقق من التسلسل الدقيق في الهدف، حيث قد يكون tetR في الاتجاه المعاكس أو قد يحتوي على تسلسل من فئة أخرى من جينات tetR. س: هل مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin (NEB #T2040) متوافقة مع مجموعة EnGen لتخليق الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) الخاصة ببكتيريا المكورات العقدية المقيحة؟ ج: نعم، يمكن تنظيف الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) المُصنّع باستخدام مجموعة EnGen لتخليق الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA) الخاصة ببكتيريا المكورات العقدية المقيحة (NEB #E3322) باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin (50 ميكروغرام، NEB #T2040) قبل تكوين معقدات البروتين النووي الريبوزي (RNP) ثم إدخاله إلى الخلايا بالتحفيز الكهربائي. س: هل من الضروري إضافة ثنائي ثيوثريتول (DTT) المرفق إلى تفاعل تخليق الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA)؟ ج: نعم. لقد أضفنا قارورة تحتوي على 0.1 مولار من ثنائي ثيوثريتول (DTT) لأننا وجدنا أنه يُحسّن الأداء ويزيد من كمية الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُستخلص. يُرجى الرجوع إلى البروتوكول والدليل المُحدّثين.