مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) من شركة نيو إنجلاند بيولابس، E3330S، NEBNext UltraExpress®

مجموعة NEBNext UltraExpress لتحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي (RNA) هي أحدث جيل من مجموعات NEBNext لتحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي، وتتميز بسير عمل سريع وسلس. بفضل بروتوكول تحضير المكتبة الذي يستغرق 3 ساعات، تُمكّن هذه المجموعة من إنشاء مكتبات RNA عالية الجودة وموجهة في يوم واحد، وذلك بالاقتران مع مجموعات إثراء mRNA أو استنفاد rRNA. الفئات ذات الصلة: تحضير المكتبات لتقنية Illumina، تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي لتقنية Illumina، مواصفات تحضير مكتبات تسلسل الجيل التالي. المواد المطلوبة (غير مُرفقة): NEBNext Multiplex Oligos لتقنية Illumina®. يمكن الاطلاع على خيارات NEBNext Multiplex Oligos على الموقع www.neb.com/oligos. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام المحولات والبادئات التي يوفرها العميل. يرجى الاطلاع على المعلومات في الرابط: https://www.neb.com/faqs/2019/03/08/can-i-use-this-nebnext-kit-with-adaptors-and-primers-from-other-vendors-than-neb مجموعة كواشف SPRIselect™ (Beckman Coulter®, Inc. #B23317) أو خرز AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881) حامل مغناطيسي (NEB S1515S، Alpaqua® cat. #A001322، أو ما يعادله) إيثانول 80% (مُحضر حديثًا) جهاز تدوير حراري أنابيب شرائح PCR خالية من DNase وRNase، على سبيل المثال TempAssure® شرائط PCR المرنة ذات 8 أنابيب (USA Scientific® #1402-4708) جهاز Bioanalyzer® أو TapeStation® (Agilent® Technologies, Inc.) والكواشف المرتبطة بها المواد الاستهلاكية: للاستخدام مع وحدة عزل mRNA متعدد الأدينين المغناطيسية NEBNext (NEB #E7490): أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل وحامل مغناطيسي NEB #S1506 أو ما يعادله (لغسل الخرز فقط). للاستخدام مع مجموعة استنفاد rRNA الإصدار 2 من NEBNext (بشري/فأر/جرذ) (NEB #E7400) ومجموعات استنفاد RNA الأخرى من NEBNext التي لا تحتوي على خرز (NEB #E7750، E7850، E7865): خرز Agencourt® RNAClean® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63987). الأسئلة الشائعة : س: هل مجموعة تحضير مكتبة RNA UltraExpress® من NEBNext هي مجموعة مكتبة موجهة (متعددة السلاسل)؟ ج: نعم، تحتوي مجموعة مكتبة RNA UltraExpress من NEBNext على سير عمل مكتبة RNA موجه (متعدد السلاسل). س: ما الفرق بين مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي NEBNext UltraExpress® ومجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext® Ultra™ II؟ وكيف أختار المجموعة المناسبة؟ ج: تم تحسين مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي NEBNext UltraExpress لتبسيط عملية تحضير المكتبات، حيث يتم استخدام تركيز واحد للمُحَوِّل وظروف دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) واحدة لجميع العينات ضمن الكميات الأولية من 25 إلى 250 نانوغرام من الحمض النووي الريبوزي الكلي. أما مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext Ultra II، فتتميز بظروف أكثر تخصيصًا بناءً على كمية المدخلات، وخطوات وتنظيفات أكثر، ووقت عمل أطول، وتوصيات بنطاق مدخلات أوسع (من 10 نانوغرام إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي الكلي). تُنتج كلتا المجموعتين كميات كبيرة من المكتبات عالية الجودة، ولكننا نوصي باختيار NEBNext UltraExpress RNA لجميع عيناتك القياسية ضمن نطاق كمية المدخلات المذكور، حيث تُعد السرعة أمرًا بالغ الأهمية. ونوصي باختيار NEBNext Ultra II Directional RNA للعينات الأكثر تعقيدًا وقيمة. س: هل من الممكن استخدام كميات من الحمض النووي الريبوزي الكلي خارج النطاق الموصى به لمجموعة NEBNext UltraExpress® لتحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي؟ ج: نعم. مع ذلك، قد يؤدي ذلك إلى زيادة ثنائيات المحولات أو انخفاض الإنتاجية. يجب على المستخدم إجراء تحسين تخفيفات المحولات ودورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تجريبيًا، وسيتأثر ذلك بجودة العينة. نقترح استخدام مجموعة NEBNext® Ultra™ II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina® (NEB #E7760/E7765) لكميات الحمض النووي الريبوزي الكلي خارج النطاقات الموصى بها لمجموعة NEBNext UltraExpress® لتحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي. س: هل تتضمن مجموعة NEBNext UltraExpress® لتحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي كواشف عزل الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين أو كواشف استنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي؟ ج: لا. لعزل الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين، نوصي باستخدام وحدة العزل المغناطيسي للحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين من NEBNext® (NEB #E7490). لاستنزاف الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA)، نوصي باستخدام أي من مجموعات استنزاف الحمض النووي الريبوزي (مثل مجموعة NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (بشري/فأر/جرذ)) (NEB #E7400/E7405). س: هل تأتي مجموعات NEBNext UltraExpress® Library Prep مزودة بخرز؟ ج: لا، نوصي باستخدام مجموعة SPRIselect® Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317) أو خرز AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881). س: هل يمكنني إجراء عزل الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين (poly(A) mRNA) أو استنزاف الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) ثم تجميد العينات عند -80 درجة مئوية قبل البدء في تحضير المكتبة باستخدام مجموعة NEBNext UltraExpress® RNA Library Prep Kit؟ ج: نعم، ولكن سيتطلب الأمر بعض التعديلات. إذا كنت تخطط لتجميد الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستنفد من mRNA أو rRNA قبل تحضير المكتبة، يُنصح بإذابة عيناتك في 4 ميكرولتر من محلول Tris [10 ملي مولار Tris HCl (الأس الهيدروجيني 7.5)، المرفق مع وحدة العزل المغناطيسي NEBNext® Poly(A) mRNA E7490] أو في ماء خالٍ من النيوكلياز. ثم يُنقل 2.5 ميكرولتر من هذا المحلول إلى أنبوب جديد ويُخلط مع حجم مكافئ (2.5 ميكرولتر) من مزيج تجزئة الحمض النووي الريبوزي NEBNext UltraExpress، ليصبح الحجم الإجمالي 5 ميكرولتر. من المتوقع فقدان كمية أكبر قليلاً من العينة باستخدام هذه الطريقة مقارنةً بالبروتوكول القياسي. مع ذلك، ستبقى توصيات إدخال المحولات ودورات التفاعل كما هي. بعد ذلك، تُجزأ العينة بحجم 5 ميكرولتر في المحلول. س: ماذا أفعل إذا رأيت ثنائي محول في مكتبات NEBNext UltraExpress® الخاصة بي؟ ج: صُممت خطوة التنظيف المرحلية التي تلي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) خصيصًا لتقليل ثنائي المحول. يرجى اتباع التعليمات الخاصة بهذه الخطوة كما هي مكتوبة قبل تجربة أي توصيات إضافية. إذا استمر ظهور كميات صغيرة من ثنائي المحول في العينات، فنوصي بتنظيف خرز SPRI بتركيز 0.9X بعد تجميع المكتبات أو تحسين كمية المحول. س: هل يمكن استخدام هذه المجموعة مع محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB؟ ج: نعم، من الممكن استخدام محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB مع مجموعة NEBNext® هذه. يجب أن يكون المحول من نوع T overhang، وقد يكون مردود المكتبة النهائي أقل قليلاً من استخدام محولات NEBNext لـ Illumina®. س: هل إنزيم USER الموجود في مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي NEBNext UltraExpress® (الغطاء الأزرق) هو نفسه الموجود في مجموعات بادئات الفهرسة NEBNext (الغطاء الأحمر)؟ ج: تركيبة USER في مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي NEBNext UltraExpress أحدث. مع ذلك، يمكن استخدامه بالتبادل مع الإصدار المرفق مع محول NEBNext. لا يوجد فرق في نشاط الإنزيم. س: ما أنواع العينات وجودتها المتوافقة مع مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي NEBNext UltraExpress®؟ ج: خضعت مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي NEBNext UltraExpress لاختبارات مكثفة باستخدام الحمض النووي الريبوزي المرجعي البشري الشامل، ومزيج الحمض النووي الريبوزي البكتيري، والحمض النووي الريبوزي المستخلص من الدم البشري الكامل، ولكن من المتوقع أن تكون متوافقة مع مجموعة متنوعة من أنواع العينات ذات جودة الحمض النووي الريبوزي الجيدة. على الرغم من إمكانية إنتاج مكتبات ناجحة باستخدام عينات منخفضة الجودة، إلا أن تحسين تركيز المحول وعدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ضروري للحصول على مكتبات ذات جودة جيدة. لا نوصي باستخدام أقل من 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبوزي الكلي منخفض الجودة (مثل عينات FFPE) مع مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي NEBNext UltraExpress. بالنسبة لعينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) شديدة التجزئة والعينات ذات الكمية والجودة المنخفضة، نوصي باستخدام مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext® Ultra™ II لتقنية Illumina® (NEB #E7760/E7765). س: ماذا أفعل إذا لاحظتُ وجود راسب في محلول تفاعل تحضير نهايات الحمض النووي الريبوزي Ultra II؟ ج: من الشائع رؤية راسب أبيض في محلول إصلاح نهايات الحمض النووي الريبوزي Ultra II. في هذه الحالة، اترك المزيج حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم الماصة لسحب المحلول عدة مرات لتفتيت الراسب، ثم قم برجّه سريعًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. س: هل تتضمن المجموعة محولات وبادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع NEBNext Multiplex Oligos لتقنية Illumina. للاطلاع على القائمة الكاملة، راجع مخطط اختيار NEBNext® Multiplex Oligos. لاستخدامها مع مجموعات تحضير مكتبات NEBNext، راجع دليل مجموعة تحضير المكتبات. تحتوي الأدلة الخاصة بمجموعة oligo المتعددة أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات PCR. للحصول على خيارات موازنة الألوان، يرجى الاطلاع على NEBNext® Index Oligo Selector للحصول على مجموعات الباركود الصالحة.