مجموعة نيو إنجلاند بيولابس E3350L، NEBNext® الإنزيمية لتسلسل 5hmC

فئات NEBNext ذات الصلة : الكشف عن الهيدروكسي ميثيل وتحليله، تحليل الميثيلوم، تحليل مثيلة الحمض النووي، المواد المطلوبة (غير المرفقة): جهاز Covaris® والأنابيب المطلوبة أو معدات التجزئة الأخرى، بادئات NEBNext لعلم التخلق (مجموعة الفهرس المزدوج الفريدة 2B) NEB #E3392S (24 تفاعلًا) أو المجموعة 3 NEB #E3404S (96 تفاعلًا)، أنابيب شرائح تفاعل البوليميراز المتسلسل أو صفائح 96 بئرًا، فورماميد (Sigma #F9037-100 مل)، Hi-Di™ Formamed (Thermo Fisher Scientific® #4401457) أو هيدروكسيد الصوديوم 0.1 N. يُفضل استخدام الفورماميد. في حال استخدام هيدروكسيد الصوديوم، يُرجى مراجعة الأسئلة الشائعة على صفحة الأسئلة الشائعة الخاصة بـ NEB #E3350. 80% إيثانول، 1X TE (10 ملي مولار Tris-HCl pH 8.0، 1 ملي مولار EDTA)، أو محلول TE منخفض التركيز (10 ملي مولار Tris-HCl pH 8.0، 0.1 ملي مولار EDTA)، أو 10 ملي مولار Tris-HCl pH 7.5 أو 8.0، ماء خالٍ من النيوكلياز، حامل مغناطيسي، مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext (NEB #S1515)، كتلة تبريد معدنية، مثل Diversified Biotech® (#CHAM-1000)، جهاز PCR، Agilent® Bioanalyzer®، TapeStation® أو أي محلل شظايا آخر والمواد الاستهلاكية المرتبطة به. الأسئلة الشائعة : س: ما أنواع العينات التي يمكن معالجتها باستخدام مجموعة NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3350) ووحدة تحويل NEBNext Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3365)؟ ج: يمكن استخدام تقنية NEBNext Enzymatic 5hmC-seq مع الحمض النووي الجينومي، والحمض النووي الخالي من الخلايا، والحمض النووي المُستخلص من الأنسجة المُثبتة بالفورمالين والمُضمنة في البارافين (FFPE). س: ما هي المدخلات الموصى بها لمجموعة NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3350) ووحدة تحويل NEBNext Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3365)؟ ج: تم تحسين البروتوكول للمدخلات التي تتراوح بين 0.1 و200 نانوغرام. س: ما الفرق بين مجموعة NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3350) ووحدة تحويل NEBNext Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3365)؟ ج: تحتوي مجموعة NEBNext Enzymatic 5hmC-seq على كواشف بناء مكتبة NEBNext Ultra™ II ومحول E5hmC-seq™، وكواشف لغلوكوزيل 5hmC وإزالة أمين السيتوزين؛ ومزيج NEBNext Q5U® الرئيسي وخرزات تنقية العينات. تأتي وحدة تحويل Enzymatic 5hmC-seq مزودة بكواشف لغلوكوزيل 5hmC وإزالة أمين السيتوزين، بالإضافة إلى الحمض النووي المرجعي. لا تحتوي هذه الوحدة على محول E5hmC-seq، أو كواشف بناء المكتبة والتضخيم، أو خرزات تنقية العينات. س: ما هي المحاليل المنظمة الموصى بها لتقطيع الحمض النووي عند استخدام مجموعة NEBNext Enzymatic 5hmC-seq ووحدة تحويل NEBNext 5hmC-seq؟ ج: يجب تقطيع الحمض النووي في محلول TE بتركيز 1X (10 ملي مولار تريس، 1 ملي مولار EDTA، درجة الحموضة 8.0)، أو محلول TE منخفض التركيز (10 ملي مولار تريس، 0.1 ملي مولار EDTA، درجة الحموضة 8.0)، أو محلول تريس بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 7.5 أو 8.0. لا نوصي باستخدام محلول TE بتركيز 0.1X (1 ملي مولار تريس، 0.1 ملي مولار EDTA، درجة الحموضة 8.0) أو الماء. س: ما هو تركيز محول E5hmC-seq™ وبادئات فهرسة E5hmC-seq؟ ج: تركيز محول E5hmC-seq هو 15 ميكرومولار، وتركيز بادئات فهرسة E5hmC-seq هو 10 ميكرومولار. mso-font-charset:0; MSO-generic-font-family:roman; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-536870145 1107305727 0 0 415 0;}@font-face {font-family:Calibri; بانوز-1:2 15 5 2 2 2 4 3 2 4؛ mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:swiss; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-469750017 -1040178053 9 0 511 0;}p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-unhide:no; mso-style-qformat:yes; mso-style-parent:""; margin-top:0in; margin-right:0in; margin-bottom:8.0pt; margin-left:0in; line-height:107%; mso-pagination:widow-orphan; font-size:11.0pt; font-family:"Calibri",sans-serif; mso-ascii-font-family:Calibri; mso-ascii-theme-font:minor-latin; mso-fareast-font-family:Calibri; mso-fareast-theme-font:minor-latin; mso-hansi-font-family:Calibri; mso-hansi-theme-font:minor-latin; mso-bidi-font-family:"Times New Roman"; mso-bidi-theme-font:minor-bidi;}.MsoChpDefault {mso-style-type:export-only; mso-default-props:yes; حجم الخط: 11.0 نقطة؛ mso-ansi-font-size:11.0pt; mso-bidi-font-size:11.0pt; عائلة الخط: "Calibri"، sans-serif؛ mso-ascii-font-family:Calibri؛ mso-ascii-theme-font:minor-latin; mso-fareast-font-family:Calibri; MSO-fareast-theme-font:minor-latin; mso-hansi-font-family:Calibri; mso-hansi-theme-font:minor-latin; mso-bidi-font-family:"Times New Roman"; mso-bidi-theme-font:minor-bidi; mso-font-kerning:0pt; mso-ligatures:none;}.MsoPapDefault {mso-style-type:export-only; margin-bottom:8.0pt; line-height:107%;}div.WordSection1 {page:WordSection1;} س: لماذا تتصرف خرزات تنقية العينات NEBNext® بشكل مختلف عند تنظيف العينة في بعض مراحل بروتوكول E5hmC-seq™؟ ج: يتغير سلوك الخرزات تبعًا لعملية التنظيف وخطوة تفاعل E5hmC-seq السابقة. تجف حبيبات الخرز بسرعة بعد تفاعل الغلوكوزلة، لذا من المهم العمل بسرعة في هذه الخطوة. بالإضافة إلى ذلك، تميل الخرزات إلى التكتل بسهولة أكبر أثناء التنظيف بعد تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). لا تجفف الخرزات أكثر من اللازم قبل استخلاص الحمض النووي، فقد يؤدي ذلك إلى صعوبة إعادة تعليقها، وربما انخفاض كمية الحمض النووي المستخلص. س: ما هو الحجم المتوقع لمكتبة E5hmC-seq™؟ ج: يبلغ متوسط ​​حجم مكتبات E5hmC-seq القياسية حوالي 500 زوج قاعدي. يمكن أن تختلف أحجام المكتبات، وتظل المكتبات التي يتراوح حجمها بين 400 و600 زوج قاعدي فعالة. س: كيف يتم تسلسل مكتبات E5hmC-seq™؟ ج: في تسلسل Illumina®، يتحدد طول القراءة في النهاية بحجم المكتبة ومتطلبات المستخدم. يمكن تسلسل المكتبات باستخدام قراءات 2×76 أو 2×100 أو 2×150 قاعدة. س: كيف يتم تحليل بيانات تسلسل E5hmC-seq™؟ ج: في مكتبات E5hmC-seq، يتم تسلسل 5hmC على أنه سيتوزين، بينما يتم تسلسل 5mC والسيتوزين غير الميثيلي على أنه ثايمين. بما أن السيتوزين المُعدَّل المطلوب لا يُحوَّل ويُسلسل كسيتوزين، يُمكن استخدام مسارات العمل المُعتمدة لتحليل بيانات EM-seq™ أو البيسلفيت. لدينا أيضًا مسار عمل تجريبي وبيانات نموذجية على مكتبة GitHub: https://github.com/nebiolabs/EM-seq/ س: ما هو عمق التسلسل المطلوب لمكتبات E5hmC-seq™؟ ج: يعتمد عمق التسلسل المطلوب على تطبيق المستخدم، ولكن بشكل عام، يُعد عمق 30X عمقًا مناسبًا للبدء. مع ذلك، نظرًا لأن مستويات 5hmC قد تكون منخفضة ومنتشرة في أنواع معينة من العينات، فمن المحتمل أن يكون عمق 100X أو أكثر مطلوبًا لتحديد مستويات 5hmC بدقة. س: هل يُمكن استبدال مُهايئ E5hmC-seq™ بمُهايئ آخر؟ ج: لا. تم تحسين مُهايئ E5hmC-seq™ للاستخدام مع مجموعة NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq. المحولات المُعدّلة لاحتواء قواعد 5mC غير متوافقة مع سير العمل هذا. س: هل يمكن استخدام محول E5hmC-seq™ مع EM-seq™؟ ج: تم تحسين محول E5hmC-seq™ للاستخدام في سير عمل E5hmC-seq™. لا نوصي باستخدامه لإنشاء مكتبات EM-seq™. س: هل مكتبات E5hmC-seq™ اتجاهية أم غير اتجاهية؟ ج: مكتبات E5hmC-seq™ اتجاهية. س: هل يمكن استخدام محاليل منظمة أخرى بدلاً من محلول الإذابة المرفق؟ ج: يجب استخدام محلول الإذابة عند ذكره في البروتوكول، باستثناء حالة التخزين طويل الأمد لمكتبات E5hmC-seq™ المُضخّمة بتقنية PCR، حيث يمكن استخدام محلول TE بتركيز 1X (10 ملي مولار Tris-HCl، درجة الحموضة 8.0، 1 ملي مولار EDTA) أو محلول TE منخفض التركيز (10 ملي مولار Tris-HCl، درجة الحموضة 8.0، 0.1 ملي مولار EDTA). س: ما هي مستويات التحويل النموذجية مع عينات الحمض النووي المرجعية المُرفقة؟ ج: يتم توفير عينتين مرجعيتين من الحمض النووي: حمض نووي لامدا غير مثيل وحمض نووي 5hmC T4. حمض نووي 5hmC T4 مُهدرج في سياقات CpG وCHG وCHH. بالنسبة لحمض نووي لامدا غير المثيل، عادةً ما تُلاحظ نسبة هيدروكسي ميثيل أقل من 1%، مما يشير إلى كفاءة تحويل تزيد عن 99%. أما بالنسبة لحمض نووي 5hmC T4 (جميع السيتوزينات مُهدرجة)، فعادةً ما يتم الكشف عن نسبة 5hmC تزيد عن 96% في جميع سياقات تسلسل السيتوزين الثلاثة. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي المُجزأ إنزيميًا في تقنية E5hmC-seq™؟ ج: لا نوصي باستخدام معظم مخاليط تجزئة الحمض النووي المتوفرة تجاريًا والمُعتمدة على الإنزيمات في سير عمل E5hmC-seq، لأن عمليات التقطيع الإنزيمية قد تؤثر على علامات المثيلة على الحمض النووي. مع ذلك، صُمم NEBNext UltraShear™ (NEB #M7634) خصيصًا لتجزئة الحمض النووي مع الحفاظ على علامات المثيلة. للحصول على توصيات محددة بشأن استخدام NEBNext UltraShear مع NEBNext® E5hmC-seq، يُرجى التواصل مع الدعم الفني لشركة NEB. س: هل يُمكنني استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بدلًا من الفورماميد لفصل سلسلتي الحمض النووي قبل خطوة تفاعل إزالة الأمين في بروتوكول E5hmC-seq؟ ج: نعم، يُمكن استخدام هيدروكسيد الصوديوم، مع أن الفورماميد هو المُفضل. في حال استخدام هيدروكسيد الصوديوم، من الضروري أن يكون تركيز محلول هيدروكسيد الصوديوم دقيقًا، وأن يكون الحجم المُضاف إلى التفاعل 4 ميكرولتر بالضبط. هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) مادة شديدة التآكل. يجب اتباع إرشادات السلامة المحلية والمؤسسية عند التعامل معه. عند تحضير محلول مخفف من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 2 مولار، تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي لا يقل عن 12.5. تحقق من الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي قبل الاستخدام. تجنب التخفيفات غير الدقيقة بتحضير حجم كافٍ من هيدروكسيد الصوديوم المخفف لتقليل أخطاء السحب بالماصة. نوصي بتحضير 1 مل على الأقل. حضّر محاليل هيدروكسيد الصوديوم المخففة طازجة أو خزّن أجزاءً مخففة في درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر لتجنب تغير التركيز. هيدروكسيد الصوديوم الصلب مادة متميعة (تمتص الرطوبة من الجو). لا يمكن وزنه بدقة. لذلك، يجب معايرة المحاليل المحضرة من حبيبات هيدروكسيد الصوديوم للوصول إلى التركيز المناسب. سؤال: هل تكشف مكتبات E5hmC-seq™ عن 5mC؟ جواب: لا، تكشف مكتبات E5hmC-seq تحديدًا عن 5hmC. علاوة على ذلك، لا يمكن التمييز بين السيتوزينات غير الممثيلة و5mC. لتحديد 5mC فقط، يحتاج المستخدمون إلى تحضير مكتبتين ثم إجراء تحليل طرحي للبيانات. تكشف مكتبات EM-seq™ عن 5mC و5hmC، بينما تحدد مكتبات E5hmC-seq جزيء 5hmC فقط. وبالتالي، فإن طرح بيانات E5hmC-seq من بيانات EM-seq يوفر معلومات عن 5mC. س: هل تتوفر أوراق عينات للاستخدام مع بادئات NEBNext® لعلم التخلق؟ ج: يمكن العثور على أوراق العينات في قسم إرشادات الاستخدام في صفحات منتجات NEB #E3404S و#E3392S. س: هل المكتبات ذات الفهرسة المزدوجة متوافقة مع تسلسل الطرف الواحد؟ ج: نعم، تتوافق قليل النوكليوتيدات NEBNext لـ Illumina، بما في ذلك قليل النوكليوتيدات ذات الفهرسة المزدوجة، مع تسلسل القراءة المفردة. يرجى الرجوع إلى دليل نظرة عامة على التسلسل المفهرس من Illumina (الإصدار الحالي) للحصول على تفاصيل حول سير عمل التسلسل ذي الفهرسة المزدوجة على خلية تدفق القراءة المفردة أو خلية تدفق الطرفين المزدوجين. س: هل تتضمن المجموعة بادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع بادئات NEBNext LV الفريدة ذات الفهرس المزدوج. للاطلاع على قائمة كاملة ببادئات الفهرس المزدوج الفريدة منخفضة الحجم (LV)، يُرجى مراجعة العمود الثالث من مخطط اختيار قليل النوكليوتيدات المتعددة NEBNext®. للاستخدام مع مجموعات تحضير مكتبات NEBNext، يُرجى الرجوع إلى دليل مجموعة تحضير المكتبات. تحتوي أدلة بادئات NEBNext LV الفريدة ذات الفهرس المزدوج أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات الربط. للاطلاع على خيارات موازنة الألوان، يُرجى مراجعة مُحدد قليل النوكليوتيدات الفهرسية NEBNext® للاطلاع على تركيبات الباركود الصالحة.