وحدة تحويل تسلسل 5hmC الأنزيمية من شركة نيو إنجلاند بيولابس، E3365S، NEBNext®

فئات NEBNext ذات الصلة : الكشف عن الهيدروكسي ميثيل وتحليله، تحليل الميثيلوم، تحليل مثيلة الحمض النووي، المواصفات . المواد المطلوبة (غير متوفرة) : في حال تطلب الحمض النووي تجزئة: جهاز NEBNext UltraShear™ (NEB #M7634) أو جهاز Covaris® والأنابيب المطلوبة أو معدات التجزئة الأخرى، أنابيب شرائح تفاعل البوليميراز المتسلسل أو صفائح 96 بئرًا، خرزات التنظيف: مجموعة كواشف SPRIselect™ (Beckman Coulter®, Inc. #B23317)، خرزات AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881) أو خرزات من الشركة المصنعة المفضلة. فورماميد (Sigma #F9037-100 مل)، Hi-Di™ Formaide (Thermo Fisher Scientific® #4401457) أو هيدروكسيد الصوديوم 0.1 N. يُفضل استخدام الفورماميد. في حال استخدام هيدروكسيد الصوديوم، يُرجى مراجعة الأسئلة الشائعة على صفحة الأسئلة الشائعة الخاصة بـ NEB #E3365. 80% إيثانول، 1X TE (10 ملي مولار Tris-HCl pH 8.0، 1 ملي مولار EDTA)، أو محلول TE منخفض التركيز (10 ملي مولار Tris-HCl pH 8.0، 0.1 ملي مولار EDTA)، أو 10 ملي مولار Tris-HCl pH 7.5 أو 8.0، ماء خالٍ من النيوكلياز، حامل مغناطيسي، مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext (NEB #S1515)، كتلة تبريد معدنية، مثل Diversified Biotech® (#CHAM-1000)، جهاز PCR، Agilent® Bioanalyzer®، TapeStation® أو أي محلل شظايا آخر والمواد الاستهلاكية المرتبطة به. الأسئلة الشائعة : س: ما أنواع العينات التي يمكن معالجتها باستخدام مجموعة NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3350) ووحدة تحويل NEBNext Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3365)؟ ج: يمكن استخدام تقنية NEBNext Enzymatic 5hmC-seq مع الحمض النووي الجينومي، والحمض النووي الخالي من الخلايا، والحمض النووي المُستخلص من الأنسجة المُثبتة بالفورمالين والمُضمنة في البارافين (FFPE). س: ما هي المدخلات الموصى بها لمجموعة NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3350) ووحدة تحويل NEBNext Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3365)؟ ج: تم تحسين البروتوكول للمدخلات التي تتراوح بين 0.1 و200 نانوغرام. س: ما الفرق بين مجموعة NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3350) ووحدة تحويل NEBNext Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3365)؟ ج: تحتوي مجموعة NEBNext Enzymatic 5hmC-seq على كواشف بناء مكتبة NEBNext Ultra™ II ومحول E5hmC-seq™، وكواشف لغلوكوزيل 5hmC وإزالة أمين السيتوزين؛ ومزيج NEBNext Q5U® الرئيسي وخرزات تنقية العينات. تأتي وحدة تحويل Enzymatic 5hmC-seq مزودة بكواشف لغلوكوزيل 5hmC وإزالة أمين السيتوزين، بالإضافة إلى الحمض النووي المرجعي. لا تحتوي هذه الوحدة على محول E5hmC-seq، أو كواشف بناء المكتبة والتضخيم، أو خرزات تنقية العينات. س: ما هي المحاليل المنظمة الموصى بها لتقطيع الحمض النووي عند استخدام مجموعة NEBNext Enzymatic 5hmC-seq ووحدة تحويل NEBNext 5hmC-seq؟ ج: يجب تقطيع الحمض النووي في محلول TE بتركيز 1X (10 ملي مولار تريس، 1 ملي مولار EDTA، درجة حموضة 8.0)، أو محلول TE منخفض التركيز (10 ملي مولار تريس، 0.1 ملي مولار EDTA، درجة حموضة 8.0)، أو محلول تريس بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 7.5 أو 8.0. لا نوصي باستخدام محلول TE بتركيز 0.1X (1 ملي مولار تريس، 0.1 ملي مولار EDTA، درجة حموضة 8.0) أو الماء. س: لماذا تختلف خرزات تنقية العينات NEBNext® في بعض مراحل بروتوكول وحدة تحويل E5hmC-seq™ عند تنظيف العينة؟ ج: يتغير سلوك الخرزات تبعًا لعملية التنظيف وخطوة تفاعل وحدة تحويل E5hmC-seq السابقة. تجف حبيبات الخرز بسرعة بعد تفاعل الغلوكوزلة، لذا من المهم العمل بسرعة في هذه الخطوة. بالإضافة إلى ذلك، تميل الخرزات إلى التكتل بسهولة أكبر أثناء عملية التنظيف بعد استخدام إنزيم APOBEC. تجنب تجفيف الخرزات بشكل مفرط قبل استخلاص الحمض النووي، فقد يؤدي ذلك إلى صعوبة إعادة تعليقها، وربما انخفاض كمية الحمض النووي المستخلص. س: ما هي مستويات التحويل النموذجية مع عينات الحمض النووي المرجعية المرفقة؟ ج: يتم توفير عينتين مرجعيتين للحمض النووي: حمض نووي لامدا غير مثيل وحمض نووي 5hmC T4. حمض نووي 5hmC T4 مُهدرج في مواقع CpG وCHG وCHH. بالنسبة لحمض نووي لامدا غير المثيل، عادةً ما تُلاحظ نسبة هيدروكسي ميثيل أقل من 1%، مما يشير إلى كفاءة تحويل تزيد عن 99%. أما بالنسبة لحمض نووي 5hmC T4 (جميع السيتوزينات مُهدرجة)، فعادةً ما يتم الكشف عن نسبة 5hmC تزيد عن 96% في جميع مواقع تسلسل السيتوزين الثلاثة. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي المُجزأ إنزيميًا في تقنية E5hmC-seq™؟ ج: لا نوصي باستخدام معظم مخاليط تفتيت الحمض النووي المعتمدة على الإنزيمات والمتوفرة تجاريًا في سير عمل E5hmC-seq، لأن عمليات القص المعتمدة على الإنزيمات قد تؤثر على علامات المثيلة على الحمض النووي. مع ذلك، صُمم NEBNext UltraShear™ (NEB #M7634) خصيصًا لتفتيت الحمض النووي مع الحفاظ على علامات المثيلة. للحصول على توصيات محددة بشأن استخدام NEBNext UltraShear مع NEBNext® E5hmC-seq، يُرجى التواصل مع الدعم الفني لشركة NEB. س: هل يُمكنني استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بدلًا من الفورماميد لفصل سلسلتي الحمض النووي قبل خطوة تفاعل إزالة الأمين في بروتوكول E5hmC-seq؟ ج: نعم، يُمكن استخدام هيدروكسيد الصوديوم، مع أن الفورماميد هو المُفضل. في حال استخدام هيدروكسيد الصوديوم، من الضروري أن يكون تركيز محلول هيدروكسيد الصوديوم دقيقًا، وأن يكون الحجم المُضاف إلى التفاعل 4 ميكرولتر بالضبط. هيدروكسيد الصوديوم مادة شديدة التآكل. يجب اتباع إرشادات السلامة المحلية والمؤسسية عند التعامل معه. إذا كنت تُحضّر محلولًا مُخففًا من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 2 مولار، فتأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي لا يقل عن 12.5. تحقق من الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي قبل الاستخدام. تجنب التخفيفات غير الدقيقة بتحضير حجم كافٍ من هيدروكسيد الصوديوم المُخفف لتقليل أخطاء السحب بالماصة. نوصي بتحضير 1 مل على الأقل. حضّر محاليل هيدروكسيد الصوديوم المُخففة طازجة أو خزّن أجزاءً مُخففة منها في درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر لتجنب تغير التركيز. هيدروكسيد الصوديوم الصلب مادة مُتميعة (تمتص الرطوبة من الجو). لا يُمكن وزنه بدقة. لذلك، يجب معايرة المحاليل المُحضّرة من حبيبات هيدروكسيد الصوديوم للوصول إلى التركيز الصحيح.