نيو إنجلاند بيولابس، E3410S، مجموعة NEBNext® لتحديد كمية المكتبات لـ Ultima Genomics®

الفئات ذات الصلة بـ NEBNext: تحديد كمية مكتبات تسلسل الجيل التالي، تحضير مكتبات تسلسل الجيل التالي، الأسئلة الشائعة: س: ما هي مجموعة NEBNext® لتحديد كمية مكتبات Ultima Genomics® (NEB #E3410)؟ ج: مجموعة NEBNext لتحديد كمية مكتبات Ultima Genomics هي اختبار متخصص قائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لتحديد كمية مكتبات تسلسل الجيل التالي (NGS) الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والمحضرة باستخدام سير عمل UG 100 Solaris™ Free بدقة. س: ما هي مزايا مجموعة NEBNext® لتحديد كمية مكتبات Ultima Genomics® (NEB #E3410) القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) مقارنةً بالطرق الأخرى لتحديد كمية مكتبات NGS؟ ج: يُعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) الطريقة الأكثر دقة وفعالية لتحديد كمية المكتبات. تتميز اتساق الكمية وقابلية التكرار بمستوى أعلى بكثير مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) مقارنةً بالرحلان الكهربائي أو قياس الطيف الضوئي، اللذين يقيسان تركيز الحمض النووي الكلي. تُحدد طرق التضخيم الكمي كمية الجزيئات التي تحتوي على تسلسلات المحولات فقط، مما يوفر تقديرًا أدق لتركيز المكتبة التي يمكن تسلسلها. ونظرًا لإمكانية إعداد تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) في صفائح ذات 96 بئرًا، فإنها أكثر ملاءمةً لسير العمل عالي الإنتاجية. وبالمقارنة مع طرق qPCR الأخرى، أُدخلت عدة تحسينات إضافية على مجموعة NEBNext Library Quant Kit لجهاز Ultima Genomics لزيادة سهولة الاستخدام: إذ يمكن استخدام وقت تمديد واحد لجميع المكتبات، بغض النظر عن حجمها. صُمم مزيج Luna® Universal qPCR Master Mix بحيث لا يتطلب سوى إضافة البادئات (لا حاجة إلى إضافة الماء إلى كل تفاعل). يحتوي مزيج Luna Universal qPCR Master Mix على صبغة مرجعية سلبية عالمية، مما يُلغي الحاجة إلى إضافة ROX حتى في أجهزة الوقت الحقيقي التي تتطلب معايرة ROX. تأتي مجموعة NEBNext Library Quant Kit لجهاز Ultima Genomics مزودة بمحلول تخفيف مكتبة مركز وسهل الاستخدام. س: ما مقدار التخفيف المطلوب لمكتبتي لتشغيلها في مجموعة NEBNext® Library Quant Kit لجهاز Ultima Genomics® (NEB #E3410)؟ ج: يجب تخفيف المكتبات إلى تركيز ضمن النطاق الديناميكي للمعايير المتوفرة في مجموعة NEBNext Library Quant Kit لجهاز Ultima Genomics (0.003 بيكومولار - 30 بيكومولار). يتراوح التخفيف الأولي النموذجي بين 1:4000 و1:10000، ولكن قد يلزم إجراء تعديلات بناءً على التركيز الأولي لمكتبتك. س: ما هو وقت سير العمل لمجموعة NEBNext® Library Quant Kit؟ ج: يستغرق سير العمل لمجموعة NEBNext Library Quant Kit حوالي ساعة و50 دقيقة. منها حوالي 50 دقيقة للتشغيل اليدوي، وساعة واحدة لتشغيل الجهاز (qPCR). س: هل توفرون أي أدوات تحليلية للمساعدة في تحديد كمية المكتبات عند استخدام مجموعة NEBNext® Library Quant Kit لتقنية Ultima Genomics® (NEB #E3410)؟ ج: نعم، توفر NEB أدوات برمجية وقوالب للمساعدة في تحليل وتحديد كمية المكتبات باستخدام مجموعة NEBNext Library Quant Kit لتقنية Ultima Genomics، مما يُسهّل معالجة البيانات وتفسير النتائج. يمكن العثور على أداة التحليل في قسم NGS Library Quant ضمن NEBioCalculator. س: هل يتطلب تحديد كمية المكتبة تصحيحًا للحجم عند استخدام مجموعة NEBNext® Library Quant Kit لتقنية Ultima Genomics® (NEB #E3410)؟ ج: نعم. يرتبط الصبغ المتداخل المستخدم في مجموعة NEBNext Library Quant Kit لتقنية Ultima Genomics بالحمض النووي DNA بما يتناسب مع عدد أزواج القواعد لكل منتج DNA مزدوج السلسلة، لذا من الضروري تصحيح طول المنتج عن طريق معايرته وفقًا لحجم معيار DNA، وهو 200 زوج قاعدة. يتم ضرب جميع القيم الكمية ببساطة بمعامل تصحيح، وهو 200/حجم المكتبة. يتم ذلك تلقائيًا باستخدام أداتنا الإلكترونية لتحليل كمية مكتبات NGS. س: كم عدد المكتبات التي يمكنني تحليل كميتها في المرة الواحدة عند استخدام مجموعة NEBNext® Library Quant Kit لجهاز Ultima Genomics® (NEB #E3410)؟ ج: نوصي بإجراء تخفيفين لكل مكتبة، وإجراء كل تخفيف ثلاث مرات خلال مرحلة التطوير/التحسين. بالتالي، يمكن تحليل كمية 12 مكتبة في صفيحة 96 بئرًا باستخدام 5 معايير وعينة تحكم سلبية واحدة (NTC). بمجرد ترسيخ سير العمل، يمكن إجراء تخفيف واحد، مما يسمح بتحليل كمية 24 مكتبة لكل صفيحة 96 بئرًا باستخدام 5 معايير وعينة تحكم سلبية واحدة (NTC). س: ما هي المواد/المعلومات الأخرى التي أحتاجها لتشغيل مجموعة NEBNext® Library Quant Kit؟ ج: من الضروري معرفة متوسط ​​حجم المكتبة، لذا يُفيد التحليل باستخدام جهاز Agilent Bioanalyzer أو TapeStation أو جهاز مشابه. يتوفر محلول تخفيف مركز للمكتبة، ويجب تخفيفه باستخدام ماء خالٍ من النيوكلياز. يلزم جهاز qPCR مزود بألواح وأختام مناسبة، بالإضافة إلى معدات مخبرية قياسية مثل الماصات والأطراف والأنابيب المخروطية. س: هل أحتاج إلى إضافة ROX عند استخدام مجموعة NEBNext® Library Quant Kit لجهاز Ultima Genomics® (NEB #E3410)؟ ج: لا. يحتوي Luna® Universal qPCR Master Mix على صبغة مرجعية سلبية عالمية تُمكّن من التوافق مع مختلف أجهزة الوقت الحقيقي، بما في ذلك تلك التي لا تستخدم معايرة مرجعية سلبية وتلك التي تستخدم كمية منخفضة أو عالية من الصبغة المرجعية السلبية (ROX). س: هل يُمكنني تشغيل مجموعة NEBNext® Library Quant Kit لجهاز Ultima Genomics® (NEB #E3410) على جهاز qPCR الخاص بي؟ ج: تم اختبار مجموعة NEBNext Library Quant Kit الخاصة بـ Ultima Genomics وثبت توافقها مع أجهزة qPCR التالية، باستخدام بروتوكولات رفع درجة الحرارة القياسية أو السريعة: Bio-Rad CFX96™ Touch، Applied Biosystems® 7500 Fast، Life Technologies QuantStudio™ 6. قد تختلف تقديرات كفاءة التضخيم بين أجهزة qPCR نظرًا لاختلافات الأجهزة وبرامج التحليل. س: هل مجموعة NEBNext® Library Quant Kit الخاصة بـ Ultima Genomics® (NEB #E3410) متوافقة مع سير عمل Solaris Free وFlex على منصة Ultima Genomics؟ ج: مجموعة NEBNext Library Quant Kit الخاصة بـ Ultima Genomics متوافقة مع المكتبات المُجهزة باستخدام سير عمل UG Solaris™ Free. أما بالنسبة للمكتبات المُجهزة باستخدام سير عمل UG Solaris Flex، فيُنصح باستخدام طرق قياس كمية بديلة.