مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الصغير منخفض التحيز من شركة نيو إنجلاند بيولابس، E3420S، NEBNext®

عندما يكون الحصول على صورة كاملة لأنواع الحمض النووي الريبوزي الصغير في العينة أمرًا بالغ الأهمية، فإن مجموعة تحضير المكتبات NEBNext Low-bias Small RNA Library Prep Kit هي الوحيدة التي تفي بوعدها بتقديم تحليل منخفض التحيز. صُممت هذه المجموعة لإنتاج مكتبات تعكس بدقة النسب النسبية لأنواع الحمض النووي الريبوزي الموجودة في العينة. بفضل بروتوكولها البسيط الخالي من الجل ونطاقها الواسع، تُعد هذه المجموعة الأسرع والأكثر حساسية لتحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الصغير في السوق. الفئات ذات الصلة: تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الصغير، تحضير مكتبات تسلسل الجيل التالي. الأسئلة الشائعة : س: ما هي تركيبة محلول TE بتركيز 0.1X المرفق مع مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الصغير NEBNext Low-bias Small RNA Library Prep Kit؟ ج: محلول TE بتركيز 0.1X المرفق مع المجموعة هو 1 ملي مولار من Tris-HCl، درجة الحموضة 8.0، و0.1 ملي مولار من EDTA. س: هل المكتبات المُنتجة باستخدام مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الصغير NEBNext Low-bias Small RNA Library Prep Kit متوافقة مع تسلسل Illumina ثنائي الأطراف؟ ج: نعم، يمكن تسلسل المكتبات المُحضّرة بهذا البروتوكول باستخدام قراءات مزدوجة النهاية. مع ذلك، نظرًا لصغر حجم الإدخالات، عادةً ما تكون قراءة أحادية النهاية بطول 56 زوجًا قاعديًا كافية، وستكون القراءة الثانية زائدة عن الحاجة. س: ما هي التسلسلات اللازمة لتقليم مكتبات NEBNext Low-bias Small RNA؟ ج: يمكن استخدام التسلسلات التالية لتقليم مكتبات NEBNext Low-bias Small RNA: القراءة 1: AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA، القراءة 2: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT. س: هل هناك حاجة إلى بادئات تسلسل مخصصة لتسلسل مكتبات NEBNext Low-bias Small RNA؟ ج: لا. مكتبات NEBNext Low-bias Small RNA متوافقة مع كواشف تسلسل Illumina؛ لذلك، لا داعي لتصميم تسلسلات بادئات مخصصة. س: متى يتم ربط بادئ النسخ العكسي (RT) خلال عملية تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الصغير منخفض التحيز NEBNext (NEB #E3420)؟ ج: لا يوجد بادئ نسخ عكسي منفصل في مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الصغير منخفض التحيز NEBNext. يتم توليد بادئ النسخ العكسي من السلسلة السفلية لمحول NEBNext LB 3' خلال خطوة تفاعل ربط محول NEBNext LB 5'. س: ماذا أفعل إذا لم يكن للحمض النووي الريبوزي الخاص بي نهايات أحادية الفوسفات 5' ونهايات OH 3' قبل بدء عملية تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الصغير منخفض التحيز NEBNext (NEB #E3420)؟ ج: يمكن لإنزيم T4 PNK إضافة أحادي الفوسفات 5' إلى OH 5' وإزالة الفوسفات 3'، مما ينتج عنه OH 3'. أما التعديلات الأخرى، مثل الأغطية أو البيروفوسفات، فيجب إزالتها باستخدام إنزيمات أخرى. تواصل مع الدعم الفني لشركة NEB (info@neb.com) للحصول على توصيات. س: هل من الممكن منع تضمين كميات كبيرة من الحمض النووي الريبوزي (RNA) غير المرغوب فيه في مكتبات NEBNext Low-bias Small RNA (NEB #E3420)؟ ج: ستلتقط مجموعة تحضير مكتبات NEBNext Low-bias Small RNA جميع جزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة التي يقل طولها عن 120 نيوكليوتيدًا تقريبًا، والتي تحتوي على نهايات أحادية الفوسفات في الطرف 5' ونهايات OH في الطرف 3'، بغض النظر عن مصدرها. س: هل يمكنني استخدام الحمض النووي الريبوزي الكلي كمدخل في مجموعة تحضير مكتبات NEBNext Low-bias Small RNA (NEB #E3420)، أم أنني بحاجة إلى عزل أو إثراء جزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة تحديدًا؟ ج: يمكن استخدام كل من الحمض النووي الريبوزي الكلي وجزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة المُثرية كمدخلات في مجموعة تحضير مكتبات NEBNext Low-bias Small RNA. س: ما هي العوائد النموذجية لمكتبة NEBNext Low-bias Small RNA (NEB #E3420)؟ ج: بشكل عام، يمكن أن ينتج عن الحمض النووي الريبوزي الكلي المتوفر تجاريًا من دماغ الإنسان (RIN > 7؛ 1000 نانوغرام؛ 9 دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل) والمُعالَج في القسم 8أ من دليل المنتج (اختيار الحجم) مكتبات نهائية بتركيز 30-60 نانومولار، بينما يمكن أن ينتج عن نفس المدخلات المُعالَجة في القسم 8ب من دليل المنتج (التنظيف) مكتبات نهائية بتركيز 60-120 نانومولار. وتؤثر عوامل مثل العينة، ومحتوى الحمض النووي الريبوزي الصغير، وسلامة الحمض النووي الريبوزي، وعدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل على كمية المكتبات النهائية. س: ما مدى أهمية حجم الإيزوبروبانول في بروتوكول مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الصغير منخفضة التحيز NEBNext (NEB #E3420)؟ ج: تُعد إضافة الإيزوبروبانول بشكل صحيح خلال القسم 6 من دليل المنتج (اختيار الحجم) ضرورية لارتباط الحمض النووي التكميلي لمكتبة الحمض النووي الريبوزي الصغير بخرزات تنقية العينات NEBNext. نوصي بترطيب رؤوس الماصة مسبقًا قبل إضافة الإيزوبروبانول. س: هل يُمكنني إجراء اختيار حجم الجل للمكتبات النهائية المُنشأة باستخدام مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الصغير منخفضة التحيز NEBNext (NEB #E3420)؟ ج: تم تحسين مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الصغير منخفضة التحيز NEBNext لإزالة الحاجة إلى تنقية الجل للمكتبة النهائية. مع ذلك، إذا كنت تُفضل عزل مكتبتك من خلال اختيار حجم الجل، يُمكنك تنظيف تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) باتباع التعليمات الموجودة في القسم 8ب من دليل المنتج (التنظيف)، ثم إجراء اختيار حجم الجل على جل بولي أكريلاميد بنسبة 6%. س: ما هو رقم تعريف الحمض النووي الريبوزي (RIN) المطلوب للحمض النووي الريبوزي الكلي المُستخدم في إنشاء مكتبة الحمض النووي الريبوزي الصغير منخفضة التحيز NEBNext (NEB #E3420)؟ ج: تُنتج مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الصغير منخفضة التحيز NEBNext مكتبات حمض نووي ريبوزي صغير عالية الجودة من حمض نووي ريبوزي كلي عالي الجودة، بالإضافة إلى العينات المُتدهورة (مثل FFPE). تم اختبار هذه المجموعة على عينات ذات قيم RIN تتراوح بين 2.2 و10. عند العمل مع عينات منخفضة الجودة ومتدهورة للغاية، ستلتقط مجموعة NEBNext Low-bias Small RNA Library Prep Kit جميع جزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة التي يقل طولها عن 120 نيوكليوتيدًا تقريبًا، بغض النظر عن مصدرها، والتي تحتوي على نهايات أحادية الفوسفات في الطرف 5' ونهايات OH في الطرف 3'. س: هل تتضمن المجموعة بادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع بادئات NEBNext LV Unique Dual Index Primers. للاطلاع على قائمة كاملة ببادئات الفهرسة المزدوجة الفريدة منخفضة الحجم (LV)، يُرجى مراجعة العمود الثالث من مخطط اختيار قليل النيوكليوتيدات المتعددة NEBNext®. للاستخدام مع مجموعات تحضير المكتبات NEBNext، يُرجى الرجوع إلى دليل مجموعة تحضير المكتبات. تحتوي أدلة بادئات NEBNext LV Unique Dual Index Primers أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات الربط. للاطلاع على خيارات موازنة الألوان، يُرجى مراجعة مُحدد قليل النيوكليوتيدات الفهرسة NEBNext® للحصول على تركيبات الباركود الصالحة.