مجموعة نيو إنجلاند بيولابس E5310S، ون تاك® RT-PCR

تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) سهل وفعال بخطوتين. الفئات ذات الصلة: RT-PCR، تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) وإنزيمات النسخ العكسي. التطبيقات : RT-PCR، RT-PCR وتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA)، تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد (Multiplex PCR). الأسئلة الشائعة : س: لماذا أحصل على ناتج PCR منخفض؟ ج: هناك عدة عوامل قد تُحسّن الناتج: تحقق من تصميم البادئات باستخدام برامج الحاسوب. اضبط درجة حرارة التلدين بزيادة أو نقصان 1-2 درجة مئوية. يُعد تركيز البادئات 0.2 ميكرومول مناسبًا لمعظم تفاعلات PCR. مع ذلك، يُمكن تحسين حساسية وناتج تفاعلات RT-PCR بزيادة تركيز البادئات إلى أكثر من 0.5 ميكرومول. قد يُحسّن انخفاض تركيز البادئات بين 0.07 ميكرومول و0.2 ميكرومول من الخصوصية. زد عدد الدورات حتى 45 دورة. قم بتشغيل بدء ساخن يدويًا. استخدم أنابيب PCR رقيقة الجدران سعة 0.2 مل. جرّب بروتوكول PCR التدريجي (4). س: لماذا أحصل على كمية قليلة من الحمض النووي التكميلي (cDNA)؟ ج: هناك عدة احتمالات: تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA) عن طريق الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز المُشوه (2). يجب أن يكون للحمض النووي الريبوزي نسبة امتصاص ضوئي لا تقل عن 1.7 عند 260 نانومتر إلى 280 نانومتر عند 280 نانومتر. يمكن إزالة معظم الملوثات مثل EDTA والجوانيدينيوم عن طريق الترسيب بالإيثانول متبوعًا بغسل بالإيثانول بنسبة 70%. يمكن إزالة السكريات المتعددة عن طريق الترسيب بكلوريد الليثيوم (2). يمكن إزالة البروتينات الملوثة مثل البروتيازات عن طريق استخلاص الفينول/الكلوروفورم واستخلاص الإيثانول (2). قد يحتوي بعض الحمض النووي الريبوزي المستهدف على فترات توقف طويلة لإنزيم النسخ العكسي (RT)؛ استخدم التمهيد العشوائي بدلًا من d(T)23VN. استخدم كمية كافية من الحمض النووي الريبوزي. س: لماذا أرى نواتج ذات حجم خاطئ؟ ج: قد يكون هناك عدة أسباب: غالبًا ما يكون وجود ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أكبر من المتوقع ناتجًا عن تلوث الحمض النووي الجينومي. عالجه بإنزيم DNase I قبل تخليق الحمض النووي التكميلي (5). إن وجود ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بالحجم الصحيح في عينة التحكم السلبية (-RT) يعود إما إلى تلوث الحمض النووي الجينومي أو إلى بقايا ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل. استخدم مناطق منفصلة لتجميع التفاعل وتحليل الناتج. استخدم بادئات تغطي حدود الإكسون-إكسون. يمكن التخلص من نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل غير النوعية بتحسين تفاعلات البوليميراز المتسلسل، وذلك باتباع الخطوات التالية: (1) فحص البادئات باستخدام برنامج حاسوبي، (2) زيادة درجة حرارة التلدين بمقدار درجة مئوية واحدة في كل مرة، (3) خفض تركيز البادئات إلى 75 نانومتر.