نيو إنجلاند بيولابس، E5315S، مجموعة OneTaq® One-Step RT-PCR

تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي أحادي الخطوة سهل وفعال. الفئات ذات الصلة : تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي، تخليق الحمض النووي المكمل، وإنزيمات النسخ العكسي. التطبيقات: تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي، تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي وتخليق الحمض النووي المكمل، أسئلة شائعة حول تفاعل البوليميراز المتسلسل. س: كيف أختار بين بروتوكول تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي أحادي الخطوة وبروتوكول تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي ثنائي الخطوة؟ ج: يوفر كلا البروتوكولين، أحادي الخطوة وثنائي الخطوة، كشفًا قويًا لأهداف الحمض النووي الريبي. بناءً على تصميم تجربتك وأهدافك، قد تفضل أحد البروتوكولين على الآخر. يرجى الرجوع إلى الجدول التالي: س: ما الفرق بين NEB #E6560 وNEB #E5315؟ ج: تستخدم كلتا المجموعتين إنزيم النسخ العكسي ProtoScript II لتخليق الحمض النووي المكمل من السلسلة الأولى. إنزيم النسخ العكسي ProtoScript II هو إنزيم نسخ عكسي M-MuLV متحور ذو نشاط RNase H منخفض وثبات حراري متزايد. NEB #E6560 هي مجموعة لتخليق الحمض النووي المكمل من السلسلة الأولى. يمكن استخدام هذا المنتج في تحليلات PCR أو qPCR اللاحقة. NEB #E5315 عبارة عن مجموعة RT-PCR بخطوة واحدة؛ منتجها عبارة عن منتج PCR خاص بالحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA). س: كيف يعمل بروتوكول مجموعة RT-PCR بخطوة واحدة مع NEB #E5315؟ ج: تسمح تفاعلات RT-PCR بخطوة واحدة بتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) وتضخيم PCR في نفس محلول التفاعل. تتم برمجة جهاز التدوير الحراري بحيث يتم تخليق cDNA أولاً (48 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة)، ثم يتم تعطيل إنزيم النسخ العكسي بينما يتم تنشيط بوليميراز Taq Hot Start (94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة)، يليه 40 دورة من تضخيم PCR. س: هل يمكنني استخدام حجم تفاعل 25 ميكرولتر بدلاً من 50 ميكرولتر باستخدام NEB #E5315؟ ج: نعم، يمكنك استخدام حجم تفاعل 25 ميكرولتر عن طريق تقليل أحجام الكواشف إلى النصف. س: ما هي الظروف المثلى لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA)؟ ج: نوصي باستخدام درجة حرارة لتخليق الحمض النووي المكمل تتراوح بين 42 و55 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة. نستخدم عادةً 48 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. س: هل أحتاج إلى تحسين مكونات التفاعل؟ ج: تعمل ظروف التفاعل القياسية لمجموعة OneTaq One-Step RT-PCR (1.6 ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم و250 ميكرومولار من النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات بتركيز 1X) بشكل جيد لمعظم الأهداف. يمكنك إضافة المزيد من كلوريد المغنيسيوم أو النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات لتحسين أداء التفاعل، ولكن في معظم الحالات، قد يكون إعادة تصميم البادئات أكثر فعالية. س: ما هي كمية قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي يجب استخدامها؟ ج: يمكن أن تكون قوالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) هي الحمض النووي الريبوزي الكلي، أو الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، أو الحمض النووي الريبوزي المُصنّع عن طريق النسخ المختبري. كقاعدة عامة، يمكن استخدام ما يصل إلى 1 ميكروغرام من قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر. س: كيف أصمم البادئات؟ ج: نوصي باتباع الإرشادات العامة لتصميم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): يتراوح طول البادئات عادةً بين 20 و40 نيوكليوتيدًا، بنسبة محتوى GC تتراوح بين 40 و60%، ويجب ألا تتشارك أزواج البادئات في تسلسلات مكملة عند الطرف 3'. س: ما هو تركيز البادئات الموصى به؟ ج: بالنسبة لمعظم الأهداف، تعمل البادئات بتركيز يتراوح بين 200 و400 نانومتر بشكل جيد. قد ترغب في معايرة تركيز البادئات ليتراوح بين 100 و800 نانومتر. س: كم عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التي يجب أن أقوم بها؟ ج: نوصي بـ 40 دورة لمعظم الأهداف. يمكن الكشف عن بعض أهداف الحمض النووي الريبي (RNA) الوفيرة بـ 25 دورة فقط. س: كيف أختار بين مجموعة LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR ومجموعة OneTaq One-Step RT-PCR (NEB #E5315)؟ ج: تُمكّن كلتا المجموعتين من إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) بخطوة واحدة. يرجى الرجوع إلى الجدول أدناه كدليل للاختيار بين مجموعة LunaScript ومجموعة OneTaq One-Step RT-PCR (NEB #E5315).