نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا من الإشريكية القولونية، E5360S، من شركة نيو إنجلاند بيولابس، NEBExpress®

الفئات ذات الصلة بـ NEBExpress: NEBExpress®، نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا، الإشريكية القولونية، التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا، تطبيقات التعبير عن البروتين. نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا NEBExpress® للإشريكية القولونية، حلول الاستنساخ والأتمتة عالية الإنتاجية، التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا، الأسئلة الشائعة : س: بناءً على تطبيقي، هل يجب عليّ استخدام نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا NEBExpress® للإشريكية القولونية (NEB #E5360) أم مجموعة تخليق البروتين في المختبر PURExpress® (NEB #E6800)؟ ج: يُعد كل من نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا NEBExpress® للإشريكية القولونية ومجموعة تخليق البروتين في المختبر PURExpress مناسبين لتخليق البروتين عالي الإنتاجية لمجموعة متنوعة من البروتينات المستهدفة، تحت سيطرة بوليميراز الحمض النووي الريبي T7. يوفر كلا المنتجين تحليلًا مريحًا للتفاعل بواسطة SDS-PAGE أو عن طريق الفحص المباشر. يتوافق كلا النظامين مع قوالب الحمض النووي البلازميدي والخطي. يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) كقالب. نظام PURExpress هو نظام مُعاد تركيبه، وبالتالي يوفر بيئة تفاعل أكثر دقة مع الحد الأدنى من نشاط النيوكلياز والبروتياز. تُعد تطبيقات ما بعد المعالجة، مثل التطور الموجه للبروتينات، ودراسات الترجمة، وتفاعلات البروتين/البروتين، مناسبة بشكل خاص لنظام PURExpress. كما يُعد PURExpress مثاليًا للتطبيقات التي يتم فيها استبعاد مكونات معينة من جهاز الترجمة (مجموعة PURExpress Δ (aa, tRNA)، ومجموعة PURExpress Δ RF123، ومجموعة PURExpress Δ Ribosome)، بما في ذلك دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية، والوسم الإشعاعي، ودراسات الريبوسومات. في PURExpress، تكون جميع مكونات البروتين (باستثناء الريبوسومات) مُعاد تركيبها ومُوسومة بالهيستيدين، مما يسمح بالتنقية العكسية. يُفضل استخدام نظام NEBExpress® لتخليق البروتين الخالي من الخلايا في بكتيريا الإشريكية القولونية لعزل البروتينات المُوسومة بالهيستيدين. بالإضافة إلى ذلك، يتميز بانخفاض تكلفة التفاعل، مما يجعله قابلاً للتوسع بسهولة أكبر لتطبيقات الإنتاج بكميات كبيرة. للمقارنة بين PURExpress ونظام NEBExpress® لتخليق البروتين من بكتيريا الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا، حسب التطبيق، يُرجى الرجوع إلى جدول التطبيقات الموجود ضمن علامة تبويب الأدوات والموارد. س: ما الفرق بين نظام NEBExpress® لتخليق البروتين من بكتيريا الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا ومجموعة PURExpress لتخليق البروتين في المختبر؟ ج: مجموعة PURExpress® لتخليق البروتين في المختبر هي نظام مُعاد تركيبه لتخليق البروتين، حيث تُنقى جميع المكونات اللازمة للنسخ والترجمة في المختبر (بما في ذلك بوليميراز الحمض النووي الريبي T7) من بكتيريا الإشريكية القولونية وتُخلط في محلول متعدد المكونات. جميع مكونات البروتين مُوسومة بالهيستيدين (باستثناء الريبوسوم). يحتوي PURExpress® على الحد الأدنى من نشاط النيوكلياز والبروتياز. يُدمج مزيج البروتين مع محلول تفاعل مُحسَّن لربط النسخ والترجمة. نظام NEBExpress® للتعبير الخلوي الخالي من الخلايا في بكتيريا الإشريكية القولونية هو مستخلص عالي النشاط من هذه البكتيريا، يسمح، بالاشتراك مع محلول تفاعل مُحسَّن، وإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7، ومثبط إنزيم RNase، بالنسخ والترجمة المتزامنين. كلا النظامين متوافقان مع قوالب الحمض النووي البلازميدي والخطي؛ كما يمكن استخدام الحمض النووي الريبي الرسول (mRNA) كقالب. لمقارنة نظام PURExpress ونظام NEBExpress® لتخليق البروتين الخلوي الخالي من الخلايا في بكتيريا الإشريكية القولونية حسب التطبيق، يُرجى الرجوع إلى جدول التطبيقات الموجود ضمن علامة تبويب الأدوات والموارد. سؤال: هل إنتاجية نظام NEBExpress® لتخليق البروتين الخلوي الخالي من الخلايا في بكتيريا الإشريكية القولونية قابلة للمقارنة مع مجموعة PURExpress لتخليق البروتين في المختبر؟ جواب: تعتمد إنتاجية البروتين، سواء باستخدام مجموعة PURExpress لتخليق البروتين في المختبر أو نظام NEBExpress لتخليق البروتين الخلوي الخالي من الخلايا في بكتيريا الإشريكية القولونية، على طبيعة البروتين المستهدف وظروف التفاعل. يُنتج نظام NEBExpress لتخليق البروتين في بكتيريا الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا ما يصل إلى 0.5 ملغم/مل (حتى 25 ميكروغرام لكل 50 ميكرولتر من التفاعل). بينما يُنتج نظام PURExpress ما يصل إلى 0.25 ملغم/مل (حتى 12.5 ميكروغرام لكل 50 ميكرولتر من التفاعل). تتطلب ظروف إنتاج بروتين مُحدد تحسين درجة حرارة ووقت الحضانة، بالإضافة إلى تركيز القالب والمكملات. سؤال: هل يُمكنني إنتاج بروتينات كبيرة باستخدام نظام NEBExpress لتخليق البروتين في بكتيريا الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا؟ جواب: يُمكن لنظام NEBExpress لتخليق البروتين في بكتيريا الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا إنتاج بروتينات ذات وزن جزيئي عالٍ بفضل تثبيت قالب mRNA في بيئة منخفضة النشاط لإنزيم RNase. وقد تم تخليق بروتينات تتراوح أوزانها الجزيئية بين 17 و230 كيلو دالتون بنجاح في صورتها النشطة (نتائج غير منشورة). على سبيل المثال، تم إنتاج بروتين بيتا-جالاكتوزيداز النشط وظيفيًا بوزن 230 كيلو دالتون من بكتيريا المكورات العقدية باستخدام نظام NEBExpress لتخليق البروتين الخالي من الخلايا في بكتيريا الإشريكية القولونية. س: هل يمكنني استخدام نظام NEBExpress لتخليق البروتين الخالي من الخلايا في بكتيريا الإشريكية القولونية لإضافة أحماض أمينية غير طبيعية أو أحماض أمينية موسومة إشعاعيًا؟ ج: لهذه التطبيقات، تُعد مجموعة PURExpress® لتخليق البروتين في المختبر (NEB #E6800) الخيار الأمثل. س: هل يمكن تغيير حجم التفاعل؟ ج: نعم، حجم التفاعل النموذجي هو 50 ميكرولتر، ولكن يمكن زيادته أو تقليله خطيًا. يجب تغيير حجم جميع مكونات التفاعل، بما في ذلك قالب الحمض النووي، بشكل متناسب. تم اختبار النظام بأحجام تفاعل صغيرة تصل إلى 1 ميكرولتر وكبيرة تصل إلى 2 مل. وتكون غلة تخليق البروتين متقاربة ضمن هذا النطاق. بالنسبة للأحجام الصغيرة، مثل 1 ميكرولتر، يُنصح باستخدام جهاز قذف قطرات صوتية لمعالجة السوائل (أو ما شابه). أما بالنسبة للأحجام الكبيرة، فيُفضل استخدام وعاء ذي مساحة رأسية كافية للتهوية، مع الحضانة والتحريك. س: ما هي الطرق المُتاحة لتنقية البروتين المُصنّع؟ ج: يُمكن تطبيق أي طريقة تنقية تعتمد على التقارب، حيث أن جميع البروتينات الذاتية في نظام NEBExpress لتخليق البروتين من الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا غير مُوسومة. إذا كان البروتين المُصنّع يحتوي على وسم هيستيدين، فيُمكن استخدام خرزات NEBExpress Ni-NTA المغناطيسية (NEB #S1423)، أو أعمدة NEBExpress Ni الدوارة (NEB #S1427)، أو راتنج NEBExpress Ni (NEB #S1428). إذا كان البروتين المُصنّع يحتوي على علامة بروتين ربط المالتوز (MBP)، فيمكن استخدام راتنج الأميلوز (NEB #E8021)، أو راتنج الأميلوز عالي التدفق (NEB #E8022)، أو خرز الأميلوز المغناطيسي (NEB #E8035). أما إذا كان البروتين المُصنّع يحتوي على علامة نطاق ربط الكيتين (CBD)، فيمكن استخدام راتنج الكيتين (NEB #S6651) أو خرز الكيتين المغناطيسي (NEB #E8036). س: هل يُمكنني التعبير المشترك عن بروتينات مُستهدفة مُختلفة من بلازميدات مُختلفة؟ ج: نعم، يُمكن التعبير عن أكثر من بروتين مُستهدف في تفاعل واحد، وتكون المُردودات مُشابهة لما يُلاحظ عند التعبير عن كل بروتين على حدة. س: هل أحتاج إلى تنقية البلازميد أو قالب الحمض النووي الخطي قبل التخليق؟ ج: نقاء القالب مُهم لنجاح النسخ/الترجمة في المختبر. نوصي باستخدام مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110) أو مجموعة Monarch® Spin PCR & DNA Cleanup Kit (5 ميكروغرام) (NEB #T1130) لعزل البلازميد أو الحمض النووي الخطي. بالإضافة إلى ذلك، نوصي باستخدام تركيز قالب الحمض النووي ≥ 100 نانوغرام/ميكرولتر. س: هل يتم التعبير عن الجينات الخاضعة لسيطرة المحفز البكتيري باستخدام نظام NEBExpress® لتخليق البروتين الخالي من الخلايا في بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: على الرغم من وجود بوليميراز الحمض النووي الريبي الداخلي لبكتيريا الإشريكية القولونية في مستخلص الخلية، إلا أن التعبير عن الجينات الخاضعة للمحفزات البكتيرية سيكون ضئيلاً. ستكون كمية البروتين الناتجة منخفضة جدًا مقارنةً بتخليق البروتين العالي الذي يحفزه بوليميراز الحمض النووي الريبي T7. س: ما هي الأنظمة التي توفرها NEB للتعبير عن البروتين وتنقيته؟ أ: يستفيد نظام NEBExpress® MBP Fusion and Purification System (NEB# E8201) من قوة مُحفِّز Ptac وإشارات بدء الترجمة لبروتين ربط المالتوز (MBP) لتعزيز ذوبان البروتين المطلوب وزيادة مستويات التعبير عنه في بكتيريا الإشريكية القولونية. والمنتج الناتج هو بروتين اندماجي MBP، والذي يُنقى ويُعزل في خطوتين بسيطتين: الاستخلاص بالأميلوز متبوعًا بفصل البروتين بواسطة إنزيم TEV Protease وعزله باستخدام راتنج النيكل، مما ينتج عنه بروتين مستهدف عالي النقاء وخالٍ من العلامات. أما نظام IMPACT™ System (NEB# E6901) فيستخدم عناصر ربط البروتين المُهندسة (الإنتينات) لتنقية البروتينات المُعاد تركيبها باستخدام عمود تقارب واحد للكيتين. ويتميز هذا النظام عن أنظمة دمج البروتينات الأخرى بقدرته على فصل البروتين المُعاد تركيبه عن علامة التقارب دون استخدام إنزيم بروتياز. بالإضافة إلى ذلك، يمكن عزل البروتينات المؤتلفة الأصلية التي تحتوي على مجموعة ثيوإستر في الطرف الكربوكسيلي لتطبيقات مثل التخليق الجزئي للبروتينات ووسم المواقع المحددة. توفر مجموعة K.lactis Protein Expression Kit (NEB# E1000) طريقة سهلة للتعبير عن جين معين في خميرة Kluyveromyces lactis. يمكن إنتاج البروتينات داخل الخلايا أو إفرازها باستخدام ناقل التعبير التكاملي pKLAC1 المرفق. أما مجموعة PURExpress® In Vitro Protein Synthesis Kit (NEB# E6800) فهي نظام نسخ/ترجمة خالٍ من الخلايا يعتمد على بكتيريا الإشريكية القولونية، مُعاد تكوينه من مكونات مُنقّاة. عوامل النسخ/الترجمة في الإشريكية القولونية (باستثناء الريبوسومات) مُوسومة بالهيستيدين. يمكن التعبير عن البروتين المستهدف من قوالب الحمض النووي الخطي أو البلازميدي التي تحتوي على مُحفّز T7. نظام NEBExpress™ لتخليق البروتين من بكتيريا الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا (NEB #E5360) هو نظام قائم على المستخلصات مشتق من خلايا الإشريكية القولونية، تم هندسته لإنتاج كميات كبيرة من البروتين المؤتلف في المختبر من جينات مستنسخة أسفل محفز T7 في قوالب الحمض النووي الخطي أو البلازميدي. يمكن عزل البروتين المستهدف المؤتلف بكفاءة باستخدام خرزات NEBExpress Ni-NTA المغناطيسية (NEB #S1423)، أو أعمدة الطرد المركزي (NEB #S1427)، أو الراتنج (NEB #S1428). خرزات NEBExpress™ Ni-NTA المغناطيسية (NEB #S1423)، وأعمدة NEBExpress™ Ni الدوارة (NEB #S1427)، وراتنج NEBExpress™ Ni (NEB #S1428) - مجموعة من منتجات النيكل المثبتة لعزل البروتينات الموسومة بالهيستيدين المتعدد (His-tagged) من مستخلصات الخلايا أو تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا. س: هل سيبقى البروتين المستهدف مستقرًا أثناء حضانة التخليق عند 37 درجة مئوية؟ ج: على الرغم من أن هذا النظام يعتمد على مستخلصات الخلايا، إلا أن مستوى البروتياز ضئيل للغاية. يبقى ناتج البروتين مستقرًا أثناء التخليق حتى يكتمل التفاعل ويصبح جاهزًا للتحليل أو التنقية اللاحقة. يمكن أيضًا تخزين التفاعلات عند -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل. س: بعد تفاعل تخليق البروتين الخالي من الخلايا باستخدام NEBExpress، كيف يمكنني تحليل البروتين؟ هل من الممكن استخدام SDS-PAGE الأصلي أو فحوصات وظيفية أخرى لتحديد نشاط البروتين المُعبَّر عنه؟ ج: يمكن تحميل تفاعلات تخليق البروتين في المختبر، التي ينتجها نظام NEBExpress لتخليق البروتين في بكتيريا الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا، مباشرةً على هلامات SDS-PAGE الأصلية أو المُشوهة، دون الحاجة إلى الترسيب بالأسيتون أو حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك. كما يمكن اختبار التفاعلات مباشرةً، دون تنقية البروتين، في فحوصات وظيفية (إنزيمية، لونية، فلورية، قائمة على الهلام، إلخ)، طالما أن مكونات تخليق البروتين (النيوكليوتيدات، الأحماض الأمينية، المحلول المنظم) لا تتداخل مع قياسات الفحص المحددة. س: هل يمكنني إضافة بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNAP) غير T7 RNAP إلى تفاعلات تخليق البروتين في بكتيريا الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا من نظام NEBExpress؟ ج: لا. صُمم نظام NEBExpress لتخليق البروتين في بكتيريا الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا خصيصًا للعمل مع T7 RNAP المُرفق. إذا كان الجين الذي ترغب في استهدافه يخضع لسيطرة مُحفِّز آخر غير T7، فمن الأفضل استبداله باستخدام مجموعة Q5 للتطفير الموجه للموقع (NEB #E0554S). س: هل يُمكنني استخدام تركيز أو تركيبة مختلفة من بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 في تفاعلات تخليق البروتين في بكتيريا الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا NEBExpress؟ ج: لا. صُمِّم نظام تخليق البروتين في بكتيريا الإشريكية القولونية الخالية من الخلايا NEBExpress خصيصًا للعمل مع بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 المُرفق. س: يُوصي البروتوكول برجّ التفاعلات بقوة. هل هذا ضروري؟ ج: ليس من الضروري رجّ التفاعلات بقوة إذا كانت هناك مساحة كافية في الأنابيب التي تحتوي على التفاعلات. قد يُحسِّن الرجّ من الناتج، ولكنه ليس شرطًا. إذا اخترت رجّ التفاعلات، فنوصي بالرجّ بسرعة 800-1000 دورة في الدقيقة في خلاط مُتحكَّم بدرجة حرارته (مثل Eppendorf ThermoMixer أو ما يُماثله). س: ما حجم بلازميد DHFR-His المُتحكَّم به في NEBExpress®؟ ج: يبلغ طول بلازميد التحكم DHFR-His من NEBExpress® 2775 زوجًا قاعديًا. س: يوصي البروتوكول برجّ التفاعلات بقوة. هل هذا ضروري؟ ج: إذا كانت هناك مساحة كافية في الأنابيب التي تحتوي على التفاعلات، فليس من الضروري رجّها بقوة. قد يساعد الرجّ على تحسين الناتج، ولكنه ليس ضروريًا. إذا اخترت رجّ التفاعلات، فنوصي بالرجّ بسرعة 800-1000 دورة في الدقيقة في خلاط مضبوط الحرارة (مثل Eppendorf ThermoMixer أو ما يعادله).