مجموعة استنساخ جيبسون أسيمبلي® من نيو إنجلاند بيولابس، E5510S

تمت إعادة صياغة مزيج جيبسون الرئيسي للتجميع بمكونات تحتوي على الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10229799. الفئات ذات الصلة: مجموعات تجميع الحمض النووي، والاستنساخ، والطفرات. التطبيقات: مواصفات تجميع جيبسون. المواد المطلوبة (غير المرفقة) : خيارات بوليميراز الحمض النووي الموصى بها لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5® (NEB #M0491)، بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5 Hot Start (NEB #M0493)، مزيج Q5 Hot Start عالي الدقة 2X الرئيسي (NEB #M0494)، أطباق LB (لوريا-بيرتاني) مع المضاد الحيوي المناسب. الأسئلة الشائعة : س: لست متأكدًا مما إذا كان عليّ اختيار NEBuilder HiFi DNA Assembly أو NEB Gibson Assembly؟ ما الفرق بين المنتجين؟ ج: يوفر NEBuilder HiFi DNA Assembly العديد من المزايا مقارنةً بـ NEB Gibson Assembly. تستخدم تقنية NEBuilder HiFi بوليميرازًا عالي الدقة خاصًا بها، مما يقلل من الحاجة إلى فحص/إعادة تسلسل التركيبات، ويضمن تجميعًا عالي الدقة وخاليًا من الأخطاء تقريبًا. كما تُمكّن هذه الميزة من استخدام NEBuilder في تطبيقات معينة لا يُمكن استخدام تقنية NEB Gibson Assembly فيها: إذ تُزيل NEBuilder HiFi عدم تطابق النهايات 5' و3'، ويمكن استخدامها في جولات تجميع متتالية. وهذا يوفر الوقت بتجنب خطوات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المُستهلكة للوقت. تستطيع NEBuilder HiFi ربط قطعتين من الحمض النووي المزدوج (ds-fragments) باستخدام قليل نيوكليوتيدات الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) الاصطناعي لإنشاء بسيط وسريع (مثل إدخال الرابط أو مكتبة gRNA). لمزيد من المعلومات والبيانات التفصيلية، يُرجى زيارة NEBuilderHifi.com. س: ما هي مزايا هذه الطريقة مقارنةً بطرق الاستنساخ التقليدية؟ ج: تسمح تقنية تجميع جيبسون بإدخال قطعة أو أكثر من الحمض النووي في أي موضع تقريبًا من الناقل الخطي، ولا تعتمد على وجود مواقع تقييد ضمن تسلسل معين ليتم تصنيعه أو استنساخه. لذلك، يتمتع المستخدم بتحكم كامل في ما يتم تجميعه، ويمكن تجنب إدخال تسلسل إضافي غير مرغوب فيه، والذي يُستخدم غالبًا لتسهيل معالجة تسلسلات الحمض النووي المتعددة. علاوة على ذلك، تُعد طريقة تجميع جيبسون سريعة مقارنةً بالاستنساخ القياسي القائم على إنزيمات التقييد. وأخيرًا، يمكن ربط عدد أكبر من قطع الحمض النووي في تفاعل واحد بكفاءة أعلى من الطرق التقليدية. س: ما هو حجم قطعة الحمض النووي التي يمكنني تجميعها؟ ج: تم استخدام مجموعة استنساخ تجميع جيبسون لاستنساخ قطعة من الحمض النووي بطول 15 كيلوبايت في بلازميد بطول 5.4 كيلوبايت في بكتيريا الإشريكية القولونية، ليصل الطول الإجمالي إلى 20.4 كيلوبايت. بالنسبة للمنتجات المُجمَّعة التي يزيد حجمها عن 15 كيلوبايت، توصي شركة NEB باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المُؤهَّلة (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 10-beta المُؤهَّلة للتحويل الكهربائي (NEB #C3020). س: كم عدد قطع الحمض النووي التي يمكن تجميعها في تفاعل واحد؟ ج: يعتمد عدد قطع الحمض النووي التي يمكن تجميعها في تفاعل واحد على طول القطع وتسلسلها. وقد استُخدمت تقنية جيبسون للتجميع بكفاءة لتجميع ما يصل إلى 12 قطعة مُدرجة بحجم 0.4 كيلوبايت في ناقل واحد في وقت واحد. ومع ذلك، نوصي بتجميع خمس قطع مُدرجة أو أقل في ناقل واحد في تفاعل واحد لإنتاج نسخة مُستنسخة تحتوي على القطعة المُدرجة الصحيحة. يمكن استخدام استراتيجية التجميع التسلسلي إذا تعذَّر تجميع جميع القطع في تفاعل واحد. بدلاً من ذلك، يُمكن النظر في استخدام تقنية جولدن جيت للتجميعات التي يزيد حجمها عن 6 قطع. س: ما هي أقصر التداخلات التي يُمكن استخدامها مع طريقة التجميع هذه؟ ج: لقد تم تحقيق تجميع فعال لقطع الحمض النووي ذات تداخل لا يقل عن 12 زوجًا قاعديًا، ولكن ذلك يعتمد على محتوى GC في منطقة التداخل. نوصي باستخدام تداخلات لا تقل عن 15 زوجًا قاعديًا، أو أكثر، لتجميع الحمض النووي المزدوج مع درجة انصهار (Tm) ≥ 48 درجة مئوية (زوج AT = 2 درجة مئوية وزوج GC = 4 درجات مئوية). كما أن زيادة طول التداخل بين القطع يقلل من كمية الحمض النووي اللازمة للتجميع. س: ما هي أطول التداخلات التي يمكن استخدامها مع هذه الطريقة؟ ج: تم تحسين كمية الإكسونوكلياز 5' في مزيج جيبسون الرئيسي للتجميع ووقت تفاعل التجميع البالغ 15 دقيقة لتجميع جزيئات الحمض النووي ذات تداخلات ≤ 25 زوجًا قاعديًا. إذا زاد وقت تفاعل التجميع إلى 60 دقيقة، يمكن استخدام تداخلات تصل إلى 40 زوجًا قاعديًا مع مجموعة جيبسون لاستنساخ التجميع. س: هل يمكن تجميع شظايا الحمض النووي المزدوج (dsDNA) التي يبلغ طولها 200 زوج قاعدي أو أقل باستخدام هذه الطريقة؟ ج: نعم. للحصول على أفضل النتائج، استخدم كل شظية أصغر بزيادة مولية ≥ 5 أضعاف عن الناقل (نسبة 5:1 بين الشظية المُدخلة والناقل)، وحافظ على إجمالي كمية الحمض النووي في تفاعل جيبسون بين 0.02 و0.5 بيكومول. س: هل يمكن دمج وتجميع قليل النوكليوتيدات أحادي السلسلة (ssDNA) مع شظايا الحمض النووي المزدوج (dsDNA)؟ ج: نعم. مع ذلك، يجب تحديد التركيز الأمثل لكل قليل النوكليوتيدات. كنقطة بداية، نوصي باستخدام 45 نانومول من كل قليل النوكليوتيدات الذي يقل طوله عن أو يساوي اثني عشر قليل النوكليوتيدات مكونة من 60 قاعدة تحتوي على تداخلات بطول 30 قاعدة. س: هل سينجح التفاعل عند درجات حرارة أخرى؟ ج: تم تحسين التفاعل عند 50 درجة مئوية، ولكن ثبت أنه يعمل بين 40 و50 درجة مئوية. س: هل من الضروري تنقية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عند إجراء تجميع الحمض النووي باستخدام مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix أو مزيج Gibson Assembly Master Mix؟ ج: لا داعي لتنقية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بشكل عام. يمكنك استخدام نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المنقاة مباشرةً، طالما أن الحجم الإجمالي لنواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المنقاة في تفاعل التجميع لا يتجاوز 20%. في حال استخدام كميات أكبر من نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل، نوصي باستخدام مجموعة تنقية تعتمد على الأعمدة (Monarch PCR & DNA Cleanup Kit، NEB #T1030). في حال تضخيم عدة أجزاء أو ملاحظة وجود ثنائيات البادئات، نوصي بتحسين خطوة تفاعل البوليميراز المتسلسل للحصول على أفضل النتائج. س: هل من الضروري تعطيل إنزيمات القطع بعد هضم الناقل؟ ج: لا داعي لتعطيل إنزيمات القطع بشكل عام، ولكن في بعض الحالات قد يزيد من كفاءة التحويل. إذا كان الجزء المُدخل يحمل أيضًا موقع التقييد المستخدم في تسلسل الحمض النووي الخطي، فمن الضروري تعطيل إنزيم التقييد بالحرارة قبل مزج الحمض النووي الخطي مع الجزء المُدخل في عملية تجميع جيبسون. في حال استخدام إنزيم تقييد مقاوم للحرارة لتسلسل الحمض النووي الخطي، فيجب تنقية الحمض النووي باستخدام أعمدة الحمض النووي، أو استخلاصه بالفينول-الكلوروفورم، أو استخلاصه من هلام الأغاروز بعد الفصل الكهربائي، قبل ملامسته للجزء المُدخل. س: أرغب في إنتاج شظايا متداخلة من الحمض النووي المزدوج السلسلة (dsDNA) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). هل أحتاج إلى استخدام بادئات PCR مُنقّاة بواسطة الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE) أو كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)؟ ج: لا. يمكن استخدام البادئات القياسية المُزالة الأملاح. س: هل يمكنني استخدام تداخل بطول 15 نيوكليوتيدًا يتكون بالكامل من تكرارات علامة الهيستيدين (مثل: CACCACCACCACCAC)؟ ج: لا، يجب أن تُحيط تسلسل علامة الهيستيدين من كلا الجانبين بنيوكليوتيدين على الأقل لا يُشكلان جزءًا من تسلسل علامة الهيستيدين المتكرر. بدلاً من ذلك، يمكن دمج كودونات الهيستيدين CAC وCAT لقطع هذا التسلسل المتكرر. يجب تجنب تكرار التسلسلات في نهاية منطقة التداخل. س: أرغب في تجميع قليل النوكليوتيدات أحادي السلسلة من الحمض النووي (ssDNA) لتكوين شظايا من الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA). هل أحتاج إلى استخدام قليل النوكليوتيدات المنقاة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE) أو كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)؟ ج: لا. يمكن استخدام البادئات القياسية منزوعة الأملاح. لمزيد من المعلومات، يُرجى تنزيل مذكرة التطبيق بعنوان: "بناء ناقل تعبير sgRNA-Cas9 عبر ربط قليل النوكليوتيدات أحادي السلسلة من الحمض النووي بشظايا الحمض النووي ثنائي السلسلة". س: هل يمكنني تضخيم المنتج المُجمَّع باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: نعم. يرتبط جزيء الحمض النووي المُجمَّع تساهميًا، ويمكن تضخيمه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بالإضافة إلى ذلك، إذا كان المنتج النهائي جزيء حمض نووي دائري مغلق، فيمكن استخدامه كقالب في تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA). س: ماذا أفعل إذا لم ينتج عن تفاعل التجميع أي مستعمرات، أو عدد قليل منها، أو مستنسخات ذات حجم إدخال غير صحيح بعد التحويل إلى بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: قم بتجميع وتحويل عينة التحكم الموجبة المرفقة مع مزيج جيبسون الرئيسي للتجميع. سيُثبت نجاح تجميع عينة التحكم الموجبة أن مزيج التجميع فعال وأن ظروف التحويل مناسبة. حلل التفاعل على هلام الأغاروز. سيُظهر تفاعل التجميع الفعال منتجات مُجمّعة بالحجم الصحيح واختفاء الشظايا. تحقق من تصميم البادئات لشظايا الحمض النووي المتداخلة للتأكد من وجود تداخل كافٍ لتسهيل التجميع. ضع في اعتبارك ما إذا كان الإدخال المستنسخ سامًا لبكتيريا الإشريكية القولونية، وفي هذه الحالة، يجب استخدام ناقل منخفض النسخ، مثل BAC. نظرًا لأن المنتج المُجمّع جزيء مغلق تساهميًا، يمكن تضخيمه بديلًا عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA). تشير اختباراتنا إلى أن اختيار الخلايا المؤهلة أمر بالغ الأهمية. نوصي باستخدام خلايا كيميائية عالية الكفاءة، مثل خلايا NEB 5-alpha Competent E. coli (عالية الكفاءة) (NEB #C2987). يمكن إضافة التفاعل مباشرةً إلى الخلايا دون تخفيف، مع العلم أن تخفيف مزيج التفاعل قد يُحسّن كفاءة التحويل. عند استخدام خلايا كيميائية عالية الكفاءة من موردين آخرين، إذا لم تتكون أي مستعمرات، نوصي بتخفيف التفاعل بنسبة 1:4 قبل التحويل. أما للتحويل إلى جميع الخلايا الكهربائية عالية الكفاءة، بما في ذلك خلايا NEB، فنوصي بتخفيف التفاعل بنسبة 1:3. س: كيف يُمكنني تقليل عدد مستعمرات الخلفية الناتجة عن الناقل فقط؟ ج: لتقليل مستعمرات الخلفية غير المرغوب فيها الناتجة عن الناقل فقط بشكل ملحوظ، يجب أن يكون الناقل ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) وليس قطعة تقييد. إذا استمرت مشكلة الخلفية، يُمكن معالجة الناقل المُضخّم بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) باستخدام إنزيم DpnI لإزالة بقايا القالب، إن وُجدت، والمستخرجة من هلام الأغاروز بعد الفصل الكهربائي. س: ما نوع الخلايا المؤهلة المناسبة لتحويل تركيبات الحمض النووي المُنشأة باستخدام تقنية جيبسون للتجميع؟ ج: تتوافق تركيبات الحمض النووي الناتجة مع معظم خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة. توصي شركة NEB باستخدام خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 5-alpha (عالية الكفاءة، NEB #C2987). إذا كان حجم المنتجات المُجمّعة أكبر من 10 كيلوبايت، توصي NEB باستخدام خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 10-beta (عالية الكفاءة، NEB #C3019) أو خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة كهربائيًا NEB 10-beta (NEB #C3020). إذا احتوت الجينات المُجمّعة على تسلسلات متكررة، فيجب استخدام خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة المستقرة NEB (NEB #C3040). س: هل يُمكنني استخدام التحويل الكهربائي بدلًا من التحويل الكيميائي؟ ج: نعم، ولكن من الضروري تخفيف ناتج تفاعل جيبسون للتجميع ثلاث مرات، واستخدام 1 ميكرولتر فقط للتحويل الكهربائي. ملاحظة: الخلايا المرفقة بهذه المجموعة مؤهلة كيميائيًا. س: هل هناك أي اختلافات بين مزيج جيبسون الرئيسي للتجميع (NEB #E2611) ومزيج جيبسون الرئيسي للتجميع الموجود في مجموعة جيبسون للاستنساخ (NEB #E5510)؟ ج: لا، المزيج الرئيسي هو نفسه في كلتا المجموعتين. تتضمن مجموعة جيبسون للاستنساخ (NEB #E5510) بكتيريا الإشريكية القولونية NEB 5-alpha المؤهلة كيميائيًا. س: هل هناك أي اختلافات بين متطلبات تجميع 2-3 أجزاء مقابل 4-6 أجزاء؟ ج: الاختلافات الرئيسية بينهما هي طول التسلسلات المتداخلة بين الأجزاء المتجاورة ووقت حضانة تفاعل التجميع. يوصى باستخدام بروتوكول تفاعل التجميع لمدة 15 دقيقة لتجميع 2-3 أجزاء محاطة بتداخلات من 15-25 نيوكليوتيد. يوصى باستخدام بروتوكول التجميع لمدة ساعة واحدة لتجميع ما يصل إلى 6 أجزاء، محاطة بتداخلات من 20-80 نيوكليوتيد. تكون كمية الحمض النووي الإجمالية في تجميعة من 4 إلى 6 قطع أعلى من تلك الموجودة في تجميعة من 2 إلى 3 قطع. س: لا ينتج عن تفاعل التحكم في مزيج جيبسون للتجميع أي مستعمرات. لماذا؟ ج: تشير اختباراتنا إلى أن اختيار الخلايا المؤهلة أمر بالغ الأهمية. نوصي باستخدام خلايا مؤهلة كيميائيًا عالية الكفاءة، مثل خلايا NEB 5-alpha Competent E. coli (عالية الكفاءة) (NEB #C2987). يمكن إضافة التفاعل مباشرةً إلى الخلايا دون أي تخفيف، على الرغم من أن تخفيف مزيج التفاعل قد يحسن كفاءة التحويل. مع ذلك، عند استخدام خلايا مؤهلة كيميائيًا عالية الكفاءة من بعض الموردين الآخرين، إذا لم تحصل على أي مستعمرات، نوصي بتخفيف التفاعل بنسبة 1:4 قبل التحويل. أما بالنسبة للتحويل إلى جميع الخلايا المؤهلة كهربائيًا عالية الكفاءة، بما في ذلك خلايا NEB، فنوصي بتخفيف التفاعل بنسبة 1:3. س: عند استخدام بوليميراز لا يحتوي على نشاط إكسونوكلياز 3'-5' (مثل بوليميراز الحمض النووي Taq) لتضخيم قطع الحمض النووي المستخدمة في تفاعل تجميع جيبسون، هل يجب أن أقلق بشأن عدم تطابق الطرف 3' المحتمل الناتج عن إضافة نيوكليوتيد غير مُستنسخ؟ ج: يمكن أن يؤثر هذا النوع من عدم تطابق الطرف 3' على كفاءة التجميع، خاصةً عند محاولة تجميع عدد كبير من القطع (4-6). في هذه الحالات، قد يكون من الضروري فحص المزيد من المستعمرات للحصول على النسخة المُجمّعة بشكل صحيح. ولمنع ذلك، نوصي باستخدام بوليميرازات تُنتج مُضخّمات ذات نهايات غير لاصقة، مثل بوليميراز الحمض النووي Q5 عالي الدقة. س: عندما وصلتني مجموعة استنساخ تجميع جيبسون، كانت مُخزّنة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. هل سيؤثر ذلك على مزيج تجميع جيبسون الرئيسي؟ ج: توصي شركة NEB بتخزين مزيج تجميع جيبسون الرئيسي عند درجة حرارة -20 درجة مئوية عند وصوله، ومع ذلك، فإن المزيج الرئيسي مستقر عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. عند استخدام المزيج الرئيسي لأول مرة، يُرجى نقله إلى درجة حرارة -20 درجة مئوية للتخزين المستقبلي. يجب تخزين الخلايا المؤهلة المرفقة مع مجموعة الاستنساخ عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. لا تُخزن الخلايا المؤهلة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: أرغب في استخدام NEBuilder ولكنني قلق بشأن خصوصية بيانات المستخدم. كيف تتعامل NEB مع المعلومات التي أدخلها في NEBuilder؟ ج: NEBuilder حساس لخصوصية بيانات المستخدم. في هذه المرحلة، لا تغادر تسلسلات المستخدم متصفح العميل. تتم جميع عمليات المعالجة داخل متصفح العميل. يتم الاتصال بخوادم NEB من أجل: 1. تنزيل الصفحة والتعليمات البرمجية المطلوبة إلى المتصفح. 2. استرداد ملفات المساعدة والأدلة والصور. 3. استرداد متجه العينة و/أو تسلسلات الإدخال. لا يتم نقل أي بيانات للمستخدم من المتصفح عبر جدار الحماية الخاص بك إلى خوادم NEB. يمكن التحقق من ذلك عن طريق قطع اتصالك بالإنترنت عن المتصفح بعد تحميل الصفحة. على الرغم من عدم توفر ميزة الحصول على تسلسلات المتجهات، إلا أن باقي وظائف التطبيق ستعمل بشكل جيد وستُنتج البادئات المطلوبة. برنامج NEBuilder غير مفتوح المصدر حاليًا، كما أنه غير متوفر بنسخة سطح مكتب مستقلة. س: هل يُمكنني استخدام أدوات تصميم بادئات أخرى، مثل SnapGene لتجميع جيبسون، لتصميم بادئات لتجميع الحمض النووي باستخدام NEBuilder HiFi؟ ج: قواعد تصميم البادئات متشابهة لكل من تجميع جيبسون وتجميع الحمض النووي باستخدام NEBuilder HiFi. أي بادئة مصممة لتجميع جيبسون ستعمل مع NEBuilder HiFi. مع ذلك، قد لا تعمل بعض البادئات المتوافقة مع NEBuilder HiFi مع جيبسون، لأنه على عكس مزيج جيبسون الرئيسي، يُمكن لمزيج NEBuilder HiFi الرئيسي لتجميع الحمض النووي إزالة عدم تطابق النهاية 3'. قد لا تسمح الأدوات المصممة لبادئات "جيبسون" بتصميم بادئات تستفيد من هذه الميزة في NEBuilder HiFi. على الرغم من إمكانية استخدام أدوات أخرى، توصي NEB باستخدام أداتنا المجانية، NEBuilder Assembly Tool، لأنها قادرة على تصميم بادئات تراعي نهايات الناقل الناتجة عن هضم إنزيم التقييد. س: ما نوع مقاومة المضادات الحيوية المشفرة في عنصر التحكم الإيجابي NEBuilder (عنصر التحكم في التجميع)؟ ج: عنصر التحكم الإيجابي NEBuilder عبارة عن إدخال واحد في بلازميد pUC19 مقاوم للأمبيسيلين. إذا كان مزيج التجميع يعمل بشكل صحيح، فستحصل على مستعمرات على طبق أمبيسيلين باستخدام عنصر التحكم الإيجابي NEBuilder.