نيو إنجلاند بيولابس، E6177S، NEBNext® Ultra™ II FS تحضير مكتبة الحمض النووي مع خرز تنقية العينات

الفئات ذات الصلة: تجزئة الحمض النووي DNA وتجزئة الحمض النووي الريبي RNA، تحضير مكتبة الحمض النووي DNA لتقنية Illumina، أتمتة تحضير مكتبة NEBNext® NGS ، المواد المطلوبة (غير متوفرة ): 80% إيثانول (مُحضر حديثًا)، ماء خالٍ من النيوكلياز، 0.2 مل أنابيب PCR ذات جدار رقيق، أوليغومرات NEBNext أحادية أو متعددة لتقنية Illumina (NEB #E7350، #E7335، #E7500، #E6609، #E7710، #E7730 أو #E7600)، حامل أو صفيحة مغناطيسية (مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext® (NEB #S1515S)، صفيحة Alpaqua® 96S المغناطيسية الفائقة (#A001322)، أو ما يعادلها)، جهاز PCR، جهاز طرد مركزي دقيق، لـ NEB #E7805 فقط: مجموعة كواشف SPRIselect® (Beckman Coulter, Inc.). #B23317) أو خرز AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881) اختياري: 10 ملي مولار Tris-HCl، درجة الحموضة 8.0 مع 10 ملي مولار NaCl (لتخفيف مُحَوِّل إدخال الحمض النووي < 100 نانوغرام) الأسئلة الشائعة : س: عند تحضير العينات باستخدام مجموعة NEBNext Ultra II FS لتحضير مكتبة الحمض النووي، هل يمكن أن يكون الحمض النووي المُدخل في محاليل تحتوي على EDTA؟ ج: نعم، نوصي بأن يكون الحمض النووي في محلول TE بتركيز 1X أو محلول TE منخفض التركيز يحتوي على EDTA. يمكن أيضًا أن يكون الحمض النووي في محلول Tris بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 7.0-8.0 أو في الماء. س: ماذا أفعل إذا رأيت راسبًا في محلول التفاعل Ultra II FS؟ ج: من الشائع رؤية ترسب في محلول التفاعل Ultra II FS. في حال حدوث ذلك، قم بسحب المحلول المنظم عدة مرات باستخدام الماصة لتفتيت الراسب، ثم قم برجّه سريعًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. قد تلاحظ وجود كمية صغيرة من الراسب، لكن هذا لن يؤثر على الأداء. س: هل يمكن حفظ التفاعلات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بعد خطوات التجزئة وتحضير الأطراف في سير عمل NEBNext Ultra II FS؟ ج: نعم، يمكن حفظ الحمض النووي المجزأ والمُحضر الأطراف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لعدة ساعات دون أي تأثير ملحوظ. مع ذلك، بعد التخزين طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، يُتوقع انخفاض في المردود بنسبة 20% تقريبًا. س: هل أحتاج حقًا إلى رجّ مزيج إنزيم Ultra II FS باستخدام جهاز الخلط الدوامي؟ ج: نعم، قد يؤدي عدم رجّ مزيج إنزيم Ultra II FS إلى نتائج متغيرة. س: ما نوع وكمية المادة الأولية التي أحتاجها عند تحضير المكتبات باستخدام مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي NEBNext Ultra II FS؟ ج: هذه المجموعة مناسبة لكمية تتراوح بين 100 بيكوغرام و0.5 ميكروغرام من الحمض النووي السليم. س: هل يمكنني استخدام مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي NEBNext Ultra II FS لتحويل البيسلفيت وتقنية EMSeq؟ ج: لا، مجموعة Ultra II FS غير متوافقة مع تحويل البيسلفيت أو تقنية EMSeq. نوصي باستخدام القص الميكانيكي ومجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي NEBNext Ultra II (NEB #E7645) لهذا التطبيق. س: تفاعل الربط لزج للغاية. ماذا سيحدث إذا لم يتم خلطه جيدًا؟ ج: إذا لم يتم خلط تفاعل الربط جيدًا، فقد ينتج عنه كمية قليلة من المكتبة. لضمان الخلط الجيد، يمكن سحب المحلول وإعادة وضعه باستخدام الماصة 10 مرات، أو رجه باستخدام جهاز الخلط الدوامي لمدة 3 ثوانٍ. س: هل يمكنني استخدام مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي NEBNext Ultra II FS لتحضير المكتبات للتسلسل على أجهزة تسلسل Ion Torrent؟ ج: لا، المحولات المطلوبة لتسلسل Ion Torrent لها نهايات غير لاصقة وليست ذات نهايات 5'-T بارزة، وهي غير متوافقة مع سير عمل Ultra II FS. س: ما هو تركيز بادئات الفهرسة الخاصة بي؟ ج: تركيز بادئات فهرسة NEBNext هو 10 ميكرومتر. س: أستخدم حاليًا خرز Agencourt AMPure® XP في سير عمل تحضير المكتبة. هل ستكون خرزات تنقية العينات NEBNext بديلاً مناسبًا؟ ج: نعم، خرزات تنقية العينات NEBNext هي خرزات SPRIselect® من Beckman Coulter ويمكنها استبدال خرزات AMPure في سير عملك. يُرجى اتباع بروتوكولات اختيار الحجم وتنظيف التفاعل في دليل Ultra II FS. س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext هذه مع محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB؟ ج: نعم، من المفترض أن يكون من الممكن استخدام محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB مع مجموعة NEBNext هذه. يجب أن يكون المحول من نوع T overhang، وقد يكون مردود المكتبة النهائي أقل قليلاً من استخدام محولات NEBNext لتقنية Illumina®. تتوفر تعليمات الاستخدام مع المحولات غير التابعة لـ NEBNext، والمشفرة بالكامل، بالإضافة إلى بادئات PCR العالمية P5 وP7، في كتيبات محولات NEBNext المفهرسة/UMI. يمكن العثور على هذه الكتيبات على الموقع الإلكتروني neb.com/E7416 (للحمض النووي الريبي RNA) أو neb.com/E7395 (للحمض النووي DNA). اختر كتيب مجموعة NEBNext التي ستستخدمها. كُتبت هذه الكتيبات خصيصًا لمحولات NEBNext المفهرسة/UMI، وينبغي أن يعمل البروتوكول نفسه مع محولات أخرى ذات تصميم مشابه. نوصي بإجراء تجربة أولية باستخدام مجموعة تحضير المكتبة والمحولات المفهرسة المطلوبة، مع استخدام عينات قابلة للاستهلاك لتحسين ظروف التجربة. س: هل يحتوي كاشف التجزئة المضمن في مجموعات NEBNext Ultra® II FS DNA على إنزيم NEBNext dsDNA Fragmentase®؟ ج: لا، تحتوي منتجات Ultra II FS (نظام التجزئة) على مزيج فريد من الإنزيمات التي تُجزئ الحمض النووي، وتُصلح نهاياته، وتُضيف ذيل dA، في أنبوب واحد. إنزيم Fragmentase غير مُضمن في مزيج إنزيمات FS. س: هل مجموعة NEBNext® Ultra™ II FS DNA Library Prep Kit for Illumina® متوافقة مع جميع أنواع العينات؟ ج: تم اختبار مجموعة NEBNext® Ultra™ II FS DNA Library Prep Kit for Illumina® في العديد من تطبيقات التسلسل، بما في ذلك تسلسل الجينوم الكامل، والتقاط التهجين، وتسلسل الأمبليكون، وتقييم عدد النسخ، وما إلى ذلك. وقد صُممت لزيادة عدد الجزيئات المُدمجة في مكتبة التسلسل إلى أقصى حد. ونتيجة لذلك، تُنتج هذه الطريقة مكتبات متنوعة حتى من كميات صغيرة جدًا من الحمض النووي المُدخل (< 1 نانوغرام). يرجى مراعاة ما يلي: عند استخدام تقنية FS، يمكن استبدال التعديلات الموجودة في مدخلات الحمض النووي، مثل المثيلة والهيدروكسي مثيلة، بصيغتها الأصلية. لا يُنصح باستخدام هذه الطريقة في التطبيقات التي تُدرس فيها القواعد المعدلة (مثل تسلسل EM-seq وتسلسل البيسلفيت). عند ترددات منخفضة جدًا (عادةً أقل من 0.1%)، قد تُدخل تقنية FS شوائب تُعرف باسم الكيميرات أو القراءات المتتالية في التحليل اللاحق. يمكن تصفية هذه الشوائب باستخدام fgbio FindSwitchbackReads. بالنسبة لعينات FFPE، لاحظنا زيادة في التشويش في بعض مكتبات FS. مع ذلك، ونظرًا لتنوع تلف FFPE، لا يمكن التنبؤ بالعينات التي ستُظهر تشويشًا أعلى. للحصول على أفضل جودة للبيانات، نوصي باستخدام مجموعة NEBNext Ultrashear FFPE DNA Library Prep Kit (NEB #E6655) أو مجموعة NEBNext FFPE DNA Library Prep Kit (NEB #E6650). نشجع المستخدمين على تقييم أي طريقة لتحضير المكتبة بعناية للتأكد من ملاءمتها لنوع العينة المحددة قيد الدراسة. يرجى التواصل عبر البريد الإلكتروني info@neb.com في حال وجود أي استفسارات حول تطبيقكم المحدد. س: هل تتضمن المجموعة محولًا وبادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع NEBNext Multiplex Oligos for Illumina. للاطلاع على القائمة الكاملة، راجع مخطط اختيار NEBNext® Multiplex Oligos. للاستخدام مع مجموعات تحضير مكتبة NEBNext، يُرجى الرجوع إلى دليل مجموعة تحضير المكتبة. تحتوي الأدلة الخاصة بمجموعة multiplex oligo أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات PCR. للاطلاع على خيارات موازنة الألوان، يُرجى مراجعة NEBNext® Index Oligo Selector للاطلاع على تركيبات الباركود الصالحة.