نيو إنجلاند بيولابس، E6420L، مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية/منخفض المدخلات NEBNext® لتقنية Illumina®

فئات NEBNext ذات الصلة : تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) لتقنية Illumina، مواصفات تحضير مكتبة التسلسل من الجيل التالي . المواد المطلوبة (غير متوفرة ): إيثانول 80% (مُحضر حديثًا)، ماء خالٍ من النيوكلياز، أنابيب ربط الحمض النووي (Eppendorf® #022431021)، حامل أو صفيحة مغناطيسية (مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext® (NEB #S1515S)، أو صفيحة Alpaqua® 96S المغناطيسية الفائقة (#A001322)، أو ما يعادلها)، جهاز التدوير الحراري، جهاز الطرد المركزي الدقيق، مجموعة كواشف SPRIselect (Beckman Coulter®، Inc. #B23317) أو خرز AMPure® XP (Beckman Coulter، Inc. #A63881)، جهاز Agilent® Bioanalyzer® أو محلل شظايا مماثل والمواد الاستهلاكية المرتبطة به، أنابيب شرائح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الخالية من DNase وRNase (USA Scientific) من NEBNext Oligos (USA Scientific). (1402-1708) الأسئلة الشائعة : س: ما هي كمية محلول الفوسفات الملحي (PBS) التي يمكن نقلها من عملية جمع الخلايا إلى بروتوكول تخليق وتضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA)؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، يجب ألا تتجاوز كمية محلول الفوسفات الملحي (PBS) المنقولة 5 ميكرولتر. لا يُنصح باستخدام كميات أكبر، لأنها ستؤثر سلبًا على كمية الحمض النووي التكميلي وجودة البيانات. س: ما أنواع الخلايا التي يدعمها طقم تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) أحادي الخلية/منخفض المدخلات NEBNext®؟ ج: تم تحسين الطقم للاستخدام مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا حقيقية النواة. ومع ذلك، فإن تحلل الخلايا غير متوافق مع الخلايا المثبتة أو الخلايا ذات الجدران الخلوية (مثل الخلايا النباتية والفطرية). إذا تم استخلاص حمض نووي ريبوزي (RNA) عالي الجودة من هذه العينات، فيمكن اتباع الفصل 2 الخاص بالحمض النووي الريبوزي (RNA) منخفض المدخلات لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) وتضخيمه وإنشاء المكتبة. الطقم غير متوافق مع الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) الذي يفتقر إلى ذيول متعددة الأدينين (مثل الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) من الخلايا البكتيرية). س: هل يمكنني إعادة تعليق الخلايا في محاليل/وسط غير محلول الفوسفات الملحي (PBS) قبل جمع الخلايا؟ ج: نوصي بشدة بإعادة تعليق الخلايا في محلول فوسفات ملحي (PBS) قبل جمعها. إذا لم يكن محلول PBS وحده خيارًا مناسبًا، فيمكن إعادة تعليق الخلايا في محلول PBS مُضاف إليه ألبومين مصل البقر (BSA). يمكن إضافة ما يصل إلى 0.5 نانوغرام من ألبومين مصل البقر إلى تفاعل تخليق وتضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA). إذا أُعيد تعليق الخلايا في وسط زراعة الخلايا، مثل DMEM مع 10% من مصل جنين البقر (FBS)، فيجب أن يكون حجم السائل المتبقي أثناء جمع الخلايا ضئيلاً (10-15 نانولتر). بالنسبة للخلايا المفروزة، لا تستخدم أكثر من 5 ميكرولتر من حجم السائل المتبقي. يُرجى مراجعة الأسئلة الشائعة. س: هل يجب فرز الخلايا في كاشف مُحدد؟ ج: نوصي بفرز الخلايا في محلول تحلل الخلايا 1X كما هو موضح في الدليل. س: هل يمكن استخدام الخلايا المُجمدة؟ ج: نعم. يمكن فرز الخلايا في محلول تحلل الخلايا 1X، وتجميدها سريعًا، وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. إذا تم جمع الخلايا في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) أو ماء قبل التجميد، فيُرجى تحضير محلول تحلل الخلايا بتركيز 1X وفقًا للقسم 1.2 (جمع الخلايا وتحللها) من الأدلة المرفقة مع مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) للخلايا المفردة/الكميات الصغيرة من NEBNext (NEB #E6420) أو وحدة تخليق وتضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA) للخلايا المفردة/الكميات الصغيرة من NEBNext (NEB #E6421)، مع مراعاة حجم الخلايا المخزنة. س: هل يمكن تحلل الخلايا باستخدام محاليل تحلل أخرى؟ ج: لا نوصي بتحلل الخلايا باستخدام محاليل تحلل أخرى غير المحلول المرفق. لا تتوافق المجموعة مع محاليل تحلل الخلايا التي تحتوي على أملاح الغوانيدينيوم أو المنظفات المُفسِّخة، مثل SDS. س: ما هي مدة صلاحية تخزين الحمض النووي التكميلي (cDNA) المُصنَّع (قبل تضخيمه) قبل التضخيم؟ ج: يمكن تخزين الحمض النووي التكميلي (cDNA) (قبل تضخيمه) بأمان طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية. إذا لزم تخزين العينة لفترة أطول، أضف 0.5 ميكرولتر من محلول NEBNext Cell Lysis Buffer بتركيز 10X إلى الحمض النووي التكميلي (بعد النسخ العكسي بدلاً من إضافته أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل PCR). يمكن بعد ذلك تخزين العينات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام، ولكن قد يُلاحظ انخفاض طفيف في الكمية المُنتجة. س: ما أنواع الحمض النووي الريبوزي (RNA) المتوافقة؟ ج: يُصنّع الحمض النووي التكميلي (cDNA) بشكل انتقائي مباشرةً من الحمض النووي الريبوزي (RNA) الذي يحتوي على ذيل متعدد الأدينين (poly(A))، ويكون تبديل القالب أثناء النسخ العكسي أكثر كفاءة مع قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) الذي يحتوي على بنية غطاء 5'. لذلك، تعمل المجموعة بكفاءة عالية مع عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) ذات رقم سلامة الحمض النووي الريبوزي (RIN) العالي ≥ 8. المجموعة غير مناسبة لعينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُجزأة بشدة والمُستخلصة من الأنسجة المُثبتة بالفورمالين والمُضمنة في البارافين (FFPE). س: هل يجب تنقية الحمض النووي الريبوزي الكلي المُدخل؟ ج: يجب أن تكون عينة الحمض النووي الريبوزي (RNA) خالية من الأملاح (مثل أيونات المغنيسيوم، أو أملاح الغوانيدينيوم)، وعوامل استخلاب الكاتيونات ثنائية التكافؤ (مثل EDTA، وEGTA، والسترات)، والمواد العضوية (مثل الفينول والإيثانول). في حال وجود كمية زائدة من الحمض النووي الجينومي (DNA) في عينات الحمض النووي الريبوزي، يمكن إجراء معالجة اختيارية باستخدام إنزيم DNase I. يجب تعطيل/إزالة إنزيم DNase I بعد المعالجة. س: حجم عينة الحمض النووي الريبوزي الكلي لديّ أكبر من 8 ميكرولتر. هل ما زال بإمكاني استخدام المجموعة؟ ج: نعم. بالنسبة للحمض النووي الريبوزي الكلي في الماء أو محلول TE منخفض التركيز، يمكنك استخدام ما يصل إلى 11 ميكرولتر عن طريق إلغاء إضافة الماء في القسم 2.3 (النسخ العكسي وتبديل القالب). بالنسبة للخلايا المفروزة، لا تستخدم أكثر من 5 ميكرولتر من حجم العينة المتبقية. يرجى مراجعة الأسئلة الشائعة. س: هل مزيجا تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الرئيسيان في المجموعة قابلان للتبديل؟ ج: لا. يجب استخدام مزيج NEBNext Single Cell cDNA PCR Master Mix لتضخيم الحمض النووي المكمل (cDNA) بعد تفاعل النسخ العكسي (RT)، بينما يجب استخدام مزيج NEBNext Ultra II Q5 Master Mix لتضخيم المكتبات النهائية لتسلسل Illumina®. س: هل يجب عليّ إجراء تنظيف مزدوج بالخرز بعد تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) النهائي عند استخدام كمية قليلة من الحمض النووي المكمل (cDNA)؟ ج: عند استخدام كمية قليلة من الحمض النووي المكمل (cDNA) (100-200 بيكوغرام)، قد يكون من الضروري إجراء تنظيف مزدوج بالخرز لإزالة ثنائيات المحولات الزائدة. لتحديد نقاء المكتبة، قم بتشغيل المكتبات على شريحة DNA High Sensitivity Bioanalyzer®، أو جهاز مشابه. س: ما هي كمية الحمض النووي المكمل (cDNA) التي يمكنني استخدامها لتحضير مكتبة NEBNext Ultra II FS DNA؟ ج: 100 بيكوغرام - 20 نانوغرام من الحمض النووي المكمل (cDNA) النقي. نوصي بأن يكون الحمض النووي المكمل (cDNA) في محلول TE بتركيز 1X (10 ملي مولار Tris pH 8.0، 1 ملي مولار EDTA). مع ذلك، يُمكن استخدام محلول Tris بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 7.5-8، أو محلول TE منخفض التركيز من EDTA، أو الماء. إذا كان حجم الحمض النووي المُدخل أقل من 26 ميكرولتر، أضف محلول TE حتى يصل الحجم النهائي إلى 26 ميكرولتر. س: ما هو النطاق المتوقع لحجم المكتبات المُنشأة باستخدام مجموعة NEBNext لتحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي أحادية الخلية/منخفضة المدخلات؟ ج: بناءً على البروتوكول، يتراوح النطاق المتوقع لحجم مكتبة تسلسل Illumina بين 300 و350 زوجًا قاعديًا. اضبط وقت التجزئة إذا كنت تفضل مكتبات بأحجام شظايا مختلفة. س: لماذا تختلف توصيات تخفيف المحولات وعدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم المكتبة في هذه المجموعة عن توصيات مجموعة NEBNext Ultra II FS لتحضير مكتبات الحمض النووي؟ ج: تم تحسين التوصيات في هذه المجموعة لتناسب الحمض النووي التكميلي (cDNA) المُدخل من بروتوكول تخليق وتضخيم الحمض النووي التكميلي أحادي الخلية/منخفض المدخلات، والذي يسبق بروتوكول تحضير المكتبة. س: هل تتضمن مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية/منخفض المدخلات من NEBNext محولات وبادئات؟ ج: لا، يتم توفير المحولات والبادئات بشكل منفصل. س: كيف يتم تقليم تسلسلات المحولات؟ ج: تسلسلات الأوليغومرات المستخدمة في سير العمل هي كما يلي: NEBNext Template Switching Oligo GCT AAT CAT TGC AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CAT rGrGrG NEBNext Single Cell RT Primer AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TV NEBNext Single Cell cDNA PCR Primer AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT يمكن استخدام العديد من أدوات التقليم لتقليم القراءات التي تحتوي على هذه التسلسلات في نهاياتها. نوصي باستخدام Flexbar الإصدار 3.3.0 أو أحدث. يمكنك الوصول إلى تعليمات تقليم المحولات باستخدام Flexbar من هنا: https://github.com/nebiolabs/nebnext-single-cell-rna-seq. يبلغ طول القراءة النموذجي المستخدم لتسلسل الخلية المفردة 2 × 75 زوجًا قاعديًا، ولكن يمكن تغييره بناءً على توزيع حجم الإدخال. س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext هذه مع محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB؟ ج: نعم، من الممكن استخدام محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB مع مجموعة NEBNext هذه. يجب أن يكون المحول من نوع T overhang، وقد يكون ناتج المكتبة النهائي أقل قليلاً من استخدام محولات NEBNext الخاصة بـ Illumina®. يمكنك العثور على تعليمات الاستخدام مع محولات غير تابعة لـ NEBNext، ومحولات كاملة الطول ذات ترميز شريطي، وبادئات P5 وP7 العالمية لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في أدلة محولات NEBNext المفهرسة/UMI. يمكنك العثور على هذه الأدلة على الرابط neb.com/E7416 (RNA) أو neb.com/E7395 (DNA). اختر دليل مجموعة NEBNext التي ستستخدمها. كُتبت هذه الأدلة خصيصًا لمحولات NEBNext المفهرسة/UMI، وينبغي أن يعمل البروتوكول نفسه مع محولات أخرى ذات تصميم مشابه. نوصي بإجراء تجربة أولية باستخدام مجموعة تحضير المكتبة والمحولات المفهرسة المطلوبة، مع استخدام عينات قابلة للاستهلاك لتحسين ظروف التجربة. س: هل تتضمن المجموعة محولات وبادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع NEBNext Multiplex Oligos for Illumina. للاطلاع على القائمة الكاملة، راجع مخطط اختيار NEBNext® Multiplex Oligos. للاستخدام مع مجموعات تحضير مكتبة NEBNext، راجع دليل مجموعة تحضير المكتبة. تحتوي الأدلة الخاصة بمجموعة multiplex oligo أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات PCR. للاطلاع على خيارات موازنة الألوان، يُرجى مراجعة NEBNext® Index Oligo Selector للاطلاع على تركيبات الباركود الصالحة.