وحدة تخليق وتضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA) أحادية الخلية/منخفضة المدخلات من شركة نيو إنجلاند بيولابس، E6421S، NEBNext®

الفئات ذات الصلة بـ NEBNext: تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) لمواصفات Illumina. المواد المطلوبة (غير متوفرة ): إيثانول 80% (مُحضر حديثًا)، ماء خالٍ من النيوكلياز، أنابيب ربط الحمض النووي (Eppendorf® #022431021)، حامل أو صفيحة مغناطيسية (مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext® (NEB #S1515S)، أو صفيحة Alpaqua® 96S المغناطيسية الفائقة (#A001322)، أو ما يعادلها)، جهاز التدوير الحراري، جهاز الطرد المركزي الدوامي، مجموعة كواشف SPRIselect (Beckman Coulter®, Inc. #B23317) أو خرز AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881)، جهاز Agilent® Bioanalyzer® أو محلل شظايا مماثل والمواد الاستهلاكية المرتبطة به، أنابيب شرائح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) خالية من DNase وRNase (USA® Scientific 1402-1708). الأسئلة الشائعة : س: ما مقدار محلول الفوسفات الملحي (PBS) الذي يمكن نقله من س: هل يمكن دمج جمع الخلايا في بروتوكول تخليق وتضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA)؟ ج: للحصول على أفضل النتائج، يجب ألا تتجاوز كمية الحمض النووي المتبقي في محلول الفوسفات الملحي (PBS) 5 ميكرولتر. لا يُنصح باستخدام كميات أكبر، لأنها ستؤثر سلبًا على كمية الحمض النووي المكمل وجودة البيانات. س: ما أنواع الخلايا التي يدعمها جهاز NEBNext لتخليق وتضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA) للخلايا المفردة/الإدخال المنخفض؟ ج: تم تحسين الجهاز للاستخدام مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا حقيقية النواة. مع ذلك، فإن عملية تحلل الخلايا غير متوافقة مع الخلايا المثبتة أو الخلايا ذات الجدران الخلوية (مثل الخلايا النباتية والفطرية). إذا تم استخلاص حمض نووي ريبوزي (RNA) عالي الجودة من هذه العينات، فيمكن اتباع القسم 2 من دليل المنتج الخاص بالحمض النووي الريبوزي (RNA) للإدخال المنخفض لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) وتضخيمه وإنشاء المكتبة. الجهاز غير متوافق مع الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) الذي يفتقر إلى ذيول متعددة الأدينين (مثل الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) من الخلايا البكتيرية). س: هل يمكنني إعادة تعليق الخلايا في محاليل/وسط غير محلول الفوسفات الملحي (PBS) قبل جمعها؟ ج: نوصي بشدة بإعادة تعليق الخلايا في محلول الفوسفات الملحي (PBS) قبل جمعها. إذا لم يكن استخدام محلول الفوسفات الملحي (PBS) وحده خيارًا مناسبًا، فيمكن إعادة تعليق الخلايا في محلول PBS مُدعّم بألبومين المصل البقري (BSA). يمكن إضافة ما يصل إلى 0.5 نانوغرام من ألبومين المصل البقري إلى تفاعل تخليق وتضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA). في حال إعادة تعليق الخلايا في وسط زراعة الخلايا، مثل DMEM مع 10% من مصل جنين البقر (FBS)، يجب أن يكون حجم السائل المتبقي أثناء جمع الخلايا ضئيلاً (10-15 نانولتر). بالنسبة للخلايا المفروزة، لا تستخدم أكثر من 5 ميكرولتر من حجم السائل المتبقي. يُرجى مراجعة الأسئلة الشائعة. س: هل يجب فرز الخلايا في كاشف مُحدد؟ ج: نوصي بفرز الخلايا في محلول تحلل الخلايا 1X كما هو موضح في الدليل. س: هل يمكن استخدام الخلايا المُجمدة؟ ج: نعم. يمكن فرز الخلايا في محلول تحلل الخلايا 1X، وتجميدها سريعًا، وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. إذا تم جمع الخلايا في محلول ملحي فوسفاتي (PBS) أو ماء قبل التجميد، فيُرجى تحضير محلول تحلل الخلايا بتركيز 1X وفقًا للقسم 1.2 (جمع الخلايا وتحللها) من الأدلة المرفقة مع مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) للخلايا المفردة/الكميات الصغيرة من NEBNext (NEB #E6420) أو وحدة تخليق وتضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA) للخلايا المفردة/الكميات الصغيرة من NEBNext (NEB #E6421)، مع مراعاة حجم الخلايا المخزنة. س: هل يمكن تحلل الخلايا باستخدام محاليل تحلل أخرى؟ ج: لا نوصي بتحلل الخلايا باستخدام محاليل تحلل أخرى غير المحلول المرفق. لا تتوافق المجموعة مع محاليل تحلل الخلايا التي تحتوي على أملاح الغوانيدينيوم أو المنظفات المُفسِّخة، مثل SDS. س: ما هي مدة صلاحية تخزين الحمض النووي التكميلي (cDNA) المُصنَّع (قبل تضخيمه) قبل التضخيم؟ ج: يمكن تخزين الحمض النووي التكميلي (cDNA) (قبل تضخيمه) بأمان طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية. إذا لزم تخزين العينة لفترة أطول، أضف 0.5 ميكرولتر من محلول NEBNext Cell Lysis Buffer بتركيز 10X إلى الحمض النووي التكميلي (بعد النسخ العكسي بدلاً من إضافته أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل PCR). يمكن بعد ذلك تخزين العينات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام، ولكن قد يُلاحظ انخفاض طفيف في الكمية المُنتجة. س: ما أنواع الحمض النووي الريبوزي (RNA) المتوافقة؟ ج: يُصنّع الحمض النووي التكميلي (cDNA) بشكل انتقائي مباشرةً من الحمض النووي الريبوزي (RNA) الذي يحتوي على ذيل متعدد الأدينين (poly(A))، ويكون تبديل القالب أثناء النسخ العكسي أكثر كفاءة مع قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) الذي يحتوي على بنية غطاء 5'. لذلك، تعمل المجموعة بكفاءة عالية مع عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) ذات رقم سلامة الحمض النووي الريبوزي (RIN) العالي ≥ 8. المجموعة غير مناسبة لعينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُجزأة بشدة والمُستخلصة من الأنسجة المُثبتة بالفورمالين والمُضمنة في البارافين (FFPE). س: هل يجب تنقية الحمض النووي الريبوزي الكلي المُدخل؟ ج: يجب أن تكون عينة الحمض النووي الريبوزي (RNA) خالية من الأملاح (مثل أيونات المغنيسيوم أو أملاح الغوانيدينيوم)، وعوامل استخلاب الكاتيونات ثنائية التكافؤ (مثل EDTA وEGTA والسترات)، والمواد العضوية (مثل الفينول والإيثانول). في حال وجود كمية زائدة من الحمض النووي الجينومي (DNA) في عينات الحمض النووي الريبوزي، يمكن إجراء معالجة اختيارية باستخدام إنزيم DNase I. يجب تعطيل/إزالة إنزيم DNase I بعد المعالجة. س: حجم عينة الحمض النووي الريبوزي الكلي لديّ أكبر من 8 ميكرولتر. هل يمكنني استخدام الوحدة؟ ج: نعم. بالنسبة للحمض النووي الريبوزي الكلي في الماء أو في محلول TE منخفض التركيز، يمكنك استخدام ما يصل إلى 11 ميكرولتر عن طريق إلغاء إضافة الماء المذكورة في القسم 2.3 (النسخ العكسي وتبديل القالب). بالنسبة للخلايا المفروزة، لا تستخدم حجمًا متبقيًا يزيد عن 5 ميكرولتر. يرجى مراجعة الأسئلة الشائعة. س: هل الحمض النووي التكميلي (cDNA) الناتج عن بروتوكول NEBNext لتخليق وتضخيم الحمض النووي التكميلي أحادي الخلية/منخفض الكمية متوافق مع جهاز Nextera® XT من Illumina؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي التكميلي الناتج عن هذا البروتوكول في مجموعة Nextera XT لإعداد المكتبة. نوصي بأن تكون كمية الحمض النووي التكميلي المدخلة بين 100 و300 بيكوغرام لجهاز Nextera XT. س: كيف ينبغي تقليم تسلسلات المحولات؟ ج: تسلسلات الأوليغومرات المستخدمة في سير العمل هي كالتالي: NEBNext Template Switching Oligo GCT AAT CAT TGC AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CAT rGrGrG، NEBNext Single Cell RT Primer AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TV، NEBNext Single Cell cDNA PCR Primer AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT. يمكن استخدام العديد من أدوات التقليم لتقليم القراءات التي تحتوي على هذه التسلسلات في نهاياتها. نوصي باستخدام Flexbar الإصدار 3.3.0 أو أحدث. يمكن الوصول إلى تعليمات تقليم المحولات باستخدام Flexbar هنا: https://github.com/nebiolabs/nebnext-single-cell-rna-seq يبلغ طول القراءة النموذجي المستخدم لتسلسل الخلية الواحدة 2x75bp ولكن يمكن تغيير ذلك اعتمادًا على توزيع حجم الإدخال.