نيو إنجلاند بيولابس، E6442S، NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (96 زوجًا فريدًا من البادئات ذات الفهرس المزدوج، المجموعة 2)

لتحقيق أقصى قدر من المرونة في سير العمل، إليك بعض الفئات ذات الصلة بـ NEBNext: NEBNext® Multiplex Oligos (المحولات والبادئات)، الأسئلة الشائعة حول تحضير مكتبات تسلسل الجيل التالي: س: هل تم التحقق من صحة محولات وبادئات NEBNext الخاصة بـ Illumina في سير عمل تسلسل الجيل التالي؟ ج: نعم، تم التحقق من صحة محولات وبادئات NEBNext الخاصة بـ Illumina من خلال إنشاء مكتبات الحمض النووي الجينومي، ومكتبات الرقائق، بالإضافة إلى مكتبات mRNA البشري، متبوعةً بتسلسل Illumina. س: ما هو تركيز المحول والبادئات في مجموعات NEBNext Multiplex Oligos؟ ج: تركيز المحول 15 ميكرومولار، وتركيز مزيج البادئات 10 ميكرومولار (5 ميكرومولار لكل منهما). س: هل يمكنني استخدام صفيحة البادئات ذات 96 بئرًا لإجراء تفاعلات PCR عند استخدام NEBNext® Multiplex Oligos لـ Illumina®؟ ج: لا، لا نوصي باستخدام صفيحة الـ 96 بئرًا التي تُعبأ فيها البادئات. على الرغم من وجود كمية كافية من البادئات في كل بئر لتفاعل واحد فقط، إلا أننا نوفر كمية زائدة لضمان كفاية الكمية. قد تؤدي هذه الكمية الزائدة من البادئات إلى تكوين ثنائيات البادئات أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). س: كم عدد التفاعلات التي تكفيها البادئات في كل بئر؟ ج: صُممت صفيحة البادئات للاستخدام لمرة واحدة. على الرغم من وجود كمية كافية من البادئات في كل بئر لتفاعل واحد فقط، إلا أننا نوفر كمية زائدة لضمان كفاية الكمية. نوصي بشدة بعدم استخدام أي بادئات متبقية لتجنب التلوث المتبادل مع البادئات المفهرسة الأخرى. س: هل محول NEBNext مثيل؟ ج: لا، محول NEBNext® في NEB #E6440 و#E6442 و#E6444 و#E6446 و#E6448 غير مثيل، وبالتالي فهو غير متوافق مع بروتوكولات تسلسل البيسلفيت. يُرفق مع مُحول NEBNext نسخة مُعدّلة من المُحول، بالإضافة إلى بادئات الفهرسة، في NEB #E7535. س: هل يُمكنني إجراء قراءة واحدة والحصول على تسلسلي الفهرسة؟ هل يُمكنني تشغيل كلٍ من القراءة الواحدة والقراءة المزدوجة باستخدام مكتبات ذات فهرسة مزدوجة؟ ج: نعم. يُرجى تحديد سير العمل المُناسب بناءً على نوع خلية التدفق (قراءة واحدة أو قراءة مزدوجة) عند بدء التشغيل لضمان استخدام الكيمياء الصحيحة. في حال استخدام خلية تدفق للقراءة الواحدة، يلزم استخدام صندوق بادئات تسلسل الفهرسة المزدوجة TruSeq، للقراءة الواحدة (صندوق للاستخدام لمرة واحدة) (رقم الكتالوج FC-121-1003) لتسلسل قراءتي الفهرسة. مُقتبس من موقع Illumina الإلكتروني. س: هل المكتبات ذات الفهرسة المزدوجة مُتوافقة مع تسلسل القراءة الواحدة؟ ج: نعم، تُعدّ قليل النوكليوتيدات NEBNext لـ Illumina، بما في ذلك قليل النوكليوتيدات ذات الفهرسة المزدوجة، مُتوافقة مع تسلسل القراءة الواحدة. يرجى الرجوع إلى دليل نظرة عامة على التسلسل المفهرس من Illumina (الإصدار الحالي) للاطلاع على تفاصيل سير عمل التسلسل المفهرس المزدوج على خلية تدفق أحادية القراءة أو خلية تدفق مزدوجة النهاية. س: كم عدد الفهارس المتاحة مع NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (96 زوجًا فريدًا من بادئات الفهرس المزدوج) (NEB #E6440، E6442، E6444، E6446، وE6448)؟ ج: تتكون كل مجموعة من أزواج من 96 فهرس i5 فريدًا و96 فهرس i7 فريدًا. تحتوي كل بئر من صفيحة البادئات على زوج فريد من بادئة فهرس i5 وبادئة فهرس i7، مما يوفر 96 فهرسًا مزدوجًا فريدًا. عند استخدامها معًا، يبلغ إجمالي المجموعات الخمس 480 فهرسًا للتعدد. س: هل يمكن استخدام أوليغومرات NEBNext المتعددة لتقنية Illumina (96 زوجًا فريدًا من البادئات ذات الفهرس المزدوج) (NEB #E6440، #E6442، #E6444، #E6446، و#E6448) لمعالجة مشكلة "قفز الفهرس" في خلايا التدفق المنقوشة لأجهزة Illumina؟ ج: نعم. صُممت أزواج البادئات الـ 96 الفريدة ذات الفهرس المزدوج لتسهيل التسلسل على خلايا التدفق المنقوشة لأجهزة Illumina حيث تُشكل مشكلة قفز الفهرس عائقًا. يتيح هذا المزيج الفريد من 96 فهرسًا مزدوجًا تحديد القراءات التي تم تبديل فهارسها وتصفيتها بالكامل. المرجع: https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-018-4703-0 س: أين يمكنني العثور على أوراق العينات لهذه الأوليغومرات المتعددة؟ ج: يمكن تنزيل نماذج العينات الخاصة بكل جهاز من قسم إرشادات الاستخدام الموجود ضمن علامة التبويب "البروتوكولات، الدليل، والاستخدام". إذا كنت تستخدم جهاز NovaSeq 6000 مع مجموعات الكواشف v1.0، أو MiniSeq مع مجموعات الكواشف السريعة، أو MiSeq، أو HiSeq 2000/2500 (خلية التدفق ثنائية الأطراف)، أو HiSeq 3000/4000 (خلية التدفق أحادية القراءة)، فيُرجى اختيار نموذج العينة المسمى "نموذج عينة سير عمل السلسلة الأمامية". * إذا كنت تستخدم جهاز iSeq 100 أو MiniSeq مع مجموعات الكواشف القياسية، أو أنظمة NextSeq، أو NovaSeq 6000 مع مجموعات الكواشف v1.5، أو HiSeq 2000/2500 (خلية تدفق القراءة المفردة)، أو HiSeq 3000/4000 (خلية تدفق القراءة المزدوجة)، فيُرجى اختيار ورقة العينات المُعنونة "ورقة عينات سير عمل المكمل العكسي". * * تستند أوراق العينات لدينا إلى دليل نظرة عامة على تسلسل Illumina الحالي. يُرجى اختيار ورقة العينات الصحيحة بناءً على جهاز Illumina ومجموعات الكواشف الخاصة بك. لمزيد من المعلومات حول فهرسة Illumina، يُرجى الرجوع إلى أحدث إصدار من دليل نظرة عامة على تسلسل Illumina. س: ما هي مجموعات أزواج بادئات NEBNext الفريدة ذات الفهرسة المزدوجة التي يُمكن دمجها في عملية تسلسل Illumina واحدة؟ ج: يمكن دمج جميع أرقام NEB التالية: E6440S/L، E6442S/L، E6444S/L، E6446S/L، وE6448S/L. س: كيف أستخدم ورقة العينات المُقدمة من NEB لجهازي؟ ج: عند استخدام LRM، استخدم ملف .tsv المُرفق في قسم "إرشادات الاستخدام" في صفحة المنتج. في حال عدم استخدام LRM: نزّل ورقة العينات من صفحة المنتج الخاصة بمجموعة الفهرسة التي تستخدمها من موقع NEB.com. يمكنك العثور على أوراق العينات في قسم "البروتوكولات، والأدلة، والاستخدام/إرشادات الاستخدام" أو في قسم "الأسئلة الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها/هل لديك ورقة عينات؟". بالنسبة للمكتبات ذات الفهرسة المزدوجة، تأكد من تنزيل الإصدار الصحيح من ورقة العينات وفقًا للمقال رقم 1800 في قاعدة معارف Illumina على الرابط التالي: https://knowledge.illumina.com/software/general/software-general-reference_material-list/000001800. استخدم برنامج Illumina Experiment Manager لإنشاء ورقة عينات خاصة بجهازك وإعدادات تشغيل التسلسل. أنشئ ورقة عينات بصف واحد وافتحها في برنامج Excel. انسخ تسلسلات الفهرس من ورقة عينات NEB والصقها في ملف Excel هذا. تأكد من محاذاة الأعمدة مع عناوينها. يُرجى التواصل مع الدعم الفني لشركة Illumina لأي استفسارات إضافية حول استخدام IEM أو تنسيق ورقة العينات. سؤال: ما هي التسلسلات التي يجب تقليمها لمكتبات NEBNext التي يتم تسلسلها على جهاز Illumina؟ ج: تشبه مكتبات NEBNext الخاصة بـ Illumina مكتبات TruSeq، ويمكن تقليمها مثل TruSeq: قراءة المحول 1 AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA قراءة المحول 2 AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT س: ماذا أفعل إذا تلقيت خطأ تصادم الفهرس/تصادم الباركود؟ ج: إذا تلقيت خطأ تصادم الفهرس عند فك تشفير NEBNext Multiplex Oligos، فقم بالترقية إلى: إصدار البرنامج Bclconvert 4.1.7 أو أحدث، أي إصدار من Bcl2fastq، أي إصدار من Picard، أي إصدار من IlluminaBasecallsToSam. تواصل مع الدعم الفني إذا كانت لديك أسئلة أخرى.