نيو إنجلاند بيولابس، E6446S، NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (96 زوجًا فريدًا من البادئات ذات الفهرس المزدوج، المجموعة 4)

لتحقيق أقصى قدر من المرونة في سير العمل، إليك بعض الفئات ذات الصلة بـ NEBNext: NEBNext® Multiplex Oligos (المحولات والبادئات)، الأسئلة الشائعة حول تحضير مكتبات تسلسل الجيل التالي: س: هل تم التحقق من صحة محولات وبادئات NEBNext الخاصة بـ Illumina في سير عمل تسلسل الجيل التالي؟ ج: نعم، تم التحقق من صحة محولات وبادئات NEBNext الخاصة بـ Illumina من خلال إنشاء مكتبات الحمض النووي الجينومي، ومكتبات الرقائق، بالإضافة إلى مكتبات mRNA البشري، متبوعةً بتسلسل Illumina. س: ما هو تركيز المحول والبادئات في مجموعات NEBNext Multiplex Oligos؟ ج: تركيز المحول 15 ميكرومولار، وتركيز مزيج البادئات 10 ميكرومولار (5 ميكرومولار لكل منهما). س: هل يمكنني استخدام صفيحة البادئات ذات 96 بئرًا لإجراء تفاعلات PCR عند استخدام NEBNext® Multiplex Oligos لـ Illumina®؟ ج: لا، لا نوصي باستخدام صفيحة الـ 96 بئرًا التي تُعبأ فيها البادئات. على الرغم من وجود كمية كافية من البادئات في كل بئر لتفاعل واحد فقط، إلا أننا نوفر كمية زائدة لضمان كفاية الكمية. قد تؤدي هذه الكمية الزائدة من البادئات إلى تكوين ثنائيات البادئات أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). س: كم عدد التفاعلات التي تكفيها البادئات في كل بئر؟ ج: صُممت صفيحة البادئات للاستخدام لمرة واحدة. على الرغم من وجود كمية كافية من البادئات في كل بئر لتفاعل واحد فقط، إلا أننا نوفر كمية زائدة لضمان كفاية الكمية. نوصي بشدة بعدم استخدام أي بادئات متبقية لتجنب التلوث المتبادل مع البادئات المفهرسة الأخرى. س: هل محول NEBNext مثيل؟ ج: لا، محول NEBNext® في NEB #E6440 و#E6442 و#E6444 و#E6446 و#E6448 غير مثيل، وبالتالي فهو غير متوافق مع بروتوكولات تسلسل البيسلفيت. يُرفق مع مُحول NEBNext نسخة مُعدّلة من المُحول، بالإضافة إلى بادئات الفهرسة، في NEB #E7535. س: هل يُمكنني إجراء قراءة واحدة والحصول على تسلسلي الفهرسة؟ هل يُمكنني تشغيل كلٍ من القراءة الواحدة والقراءة المزدوجة باستخدام مكتبات ذات فهرسة مزدوجة؟ ج: نعم. يُرجى تحديد سير العمل المُناسب بناءً على نوع خلية التدفق (قراءة واحدة أو قراءة مزدوجة) عند بدء التشغيل لضمان استخدام الكيمياء الصحيحة. في حال استخدام خلية تدفق للقراءة الواحدة، يلزم استخدام صندوق بادئات تسلسل الفهرسة المزدوجة TruSeq، للقراءة الواحدة (صندوق للاستخدام لمرة واحدة) (رقم الكتالوج FC-121-1003) لتسلسل قراءتي الفهرسة. مُقتبس من موقع Illumina الإلكتروني. س: هل المكتبات ذات الفهرسة المزدوجة مُتوافقة مع تسلسل القراءة الواحدة؟ ج: نعم، تُعدّ قليل النوكليوتيدات NEBNext لـ Illumina، بما في ذلك قليل النوكليوتيدات ذات الفهرسة المزدوجة، مُتوافقة مع تسلسل القراءة الواحدة. يرجى الرجوع إلى دليل نظرة عامة على التسلسل المفهرس من Illumina (الإصدار الحالي) للاطلاع على تفاصيل سير عمل التسلسل المفهرس المزدوج على خلية تدفق أحادية القراءة أو خلية تدفق مزدوجة النهاية. س: كم عدد الفهارس المتاحة مع NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (96 زوجًا فريدًا من بادئات الفهرس المزدوج) (NEB #E6440، E6442، E6444، E6446، وE6448)؟ ج: تتكون كل مجموعة من أزواج من 96 فهرس i5 فريدًا و96 فهرس i7 فريدًا. تحتوي كل بئر من صفيحة البادئات على زوج فريد من بادئة فهرس i5 وبادئة فهرس i7، مما يوفر 96 فهرسًا مزدوجًا فريدًا. عند استخدامها معًا، يبلغ إجمالي المجموعات الخمس 480 فهرسًا للتعدد. س: هل يمكن استخدام مجموعة NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 زوجًا فريدًا من البادئات ذات الفهرس المزدوج) (NEB #E6440، #E6442، #E6444، #E6446، و#E6448) لمعالجة مشكلة "قفز الفهرس" في خلايا التدفق المنقوشة لأجهزة Illumina؟ ج: نعم. صُممت هذه المجموعة الفريدة من 96 زوجًا من البادئات ذات الفهرس المزدوج لتسهيل التسلسل على خلايا التدفق المنقوشة لأجهزة Illumina حيث تُشكل مشكلة قفز الفهرس عائقًا. يتيح هذا المزيج الفريد من 96 فهرسًا مزدوجًا تحديد القراءات التي تم تبديل فهارسها وتصفيتها بالكامل. المرجع: https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-018-4703-0 س: هل لديكم أوراق عينات لاستخدامها مع مجموعة NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (مجموعة 96 زوجًا فريدًا من البادئات ذات الفهرس المزدوج، المجموعة 4)؟ ج: نعم، يمكنك العثور على ورقة عينة تحتوي على تسلسلات الفهرسة لأجهزة NovaSeq® وMiSeq® وHiSeq® 2000 وHiSeq 2500 هنا، وورقة عينة تحتوي على تسلسلات الفهرسة لأجهزة NextSeq® وMiniSeq® وHiSeq 3000 وHiSeq 4000 هنا. س: ماذا أفعل إذا كانت ورقة العينة من موقع NEB.com الإلكتروني غير متوافقة مع إصدار البرنامج الذي أستخدمه؟ ج: إذا كانت ورقة العينة غير مناسبة لإصدار البرنامج لديك، يمكنك إنشاء ورقة عينة باستخدام برنامج Illumina Experiment Manager (IEM) ونسخ تسلسلات الفهرسة من ورقة العينة ولصقها في ورقة العينة الخاصة بك. ننصحك بالتواصل مع شركة Illumina لأي استفسارات حول كيفية استخدام برنامج IEM. س: ما هي مجموعات أزواج بادئات الفهرسة المزدوجة الفريدة من NEBNext التي يمكن دمجها في عملية تسلسل واحدة باستخدام Illumina؟ ج: يمكن دمج جميع تسلسلات NEB #E6440S/L وE6442S/L وE6444S/L وE6446S/L وE6448S/L. س: ما هي التسلسلات التي يجب تقليمها لمكتبات NEBNext التي يتم تسلسلها على جهاز Illumina؟ ج: تشبه مكتبات NEBNext الخاصة بـ Illumina مكتبات TruSeq ويمكن تقليمها مثل TruSeq: قراءة المحول 1 AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA قراءة المحول 2 AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT س: ماذا أفعل إذا تلقيت خطأ تصادم الفهرس/تصادم الباركود؟ ج: إذا تلقيت خطأ تصادم الفهرس عند فك تشفير NEBNext Multiplex Oligos، فقم بالترقية إلى: إصدار البرنامج Bclconvert 4.1.7 أو أحدث، Bcl2fastq أي إصدار، Picard IlluminaBasecallsToSam أي إصدار. تواصل مع الدعم الفني إذا كانت لديك أي أسئلة أخرى.