مجموعة نيو إنجلاند بيولابس، E6560L، بروتوسكريبت® II لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى

الفئات ذات الصلة بـ ProtoScript: تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، وتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) وإنزيمات النسخ العكسي. التطبيقات: تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA)، والنسخ العكسي (تخليق الحمض النووي المكمل)، واستنساخ الحمض النووي الريبوزي (RNA). الأسئلة الشائعة : س: كيف أختار بين مجموعة LunaScript® RT SuperMix ومجموعات ProtoScript لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من السلسلة الأولى؟ ج: تحتوي مجموعات تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من السلسلة الأولى على إنزيمات نسخ عكسي مختلفة، وتتمثل الاختلافات الرئيسية في تطبيقاتها الأساسية، وشكلها، ودرجة حرارة التفاعل. إليك ملخص لمجموعاتنا الثلاث لتخليق الحمض النووي المكمل (cDNA) من السلسلة الأولى. مجموعة LunaScript RT SuperMix (E3010) مجموعة ProtoScript II لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (E6560) مجموعة ProtoScript لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (E6300) إنزيم النسخ العكسي RT Luna إنزيم النسخ العكسي ProtoScript II إنزيم النسخ العكسي M-MuLV التنسيق Supermix مزيج التفاعل، مزيج الإنزيم، البادئ مزيج التفاعل، مزيج الإنزيم، البادئ التطبيق الأساسي RT-qPCR ثنائي الخطوات نقطة النهاية RT-PCR حتى 10 كيلوبايت نقطة النهاية RT-PCR حتى 5 كيلوبايت التطبيق الثانوي نقطة النهاية RT-PCR حتى 3 كيلوبايت RT-qPCR ثنائي الخطوات RT-qPCR ثنائي الخطوات درجة حرارة التفاعل حتى 65 درجة مئوية (55 درجة مئوية مثالية) حتى 48 درجة مئوية (42 درجة مئوية مثالية) حتى 45 درجة مئوية (42 درجة مئوية مثالية) مدخلات الحمض النووي الريبي (RNA) من 1 ميكروغرام إلى 1 بيكوغرام من 1 ميكروغرام إلى 1 بيكوغرام من 1 ميكروغرام إلى حضانة 1 بيكوغرام: 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين، 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ميزات إضافية: صبغة تتبع زرقاء، بروتوكول سريع لمدة 13 دقيقة. س: ما الفرق بين E6560 وE6300؟ ج: يحتوي E6560 على إنزيم النسخ العكسي M-MuLV H- في مزيج الإنزيمات، بينما يحتوي E6300 على إنزيم النسخ العكسي M-MuLV من النوع البري في مزيج الإنزيمات. إنزيم النسخ العكسي M-MuLV H- هو إنزيم نسخ عكسي M-MuLV متحور ذو نشاط RNase H منخفض وثبات حراري متزايد. الإنزيم نشط حتى 50 درجة مئوية، مما يوفر خصوصية أعلى، وإنتاجية أعلى من cDNA، ومنتج cDNA كامل الطول. س: ما هي درجة حرارة التفاعل لإنزيم E6560؟ ج: نوصي بـ 42 درجة مئوية للنسخ العكسي الروتيني. يمكن استخدام درجة حرارة تصل إلى 50 درجة مئوية. إنزيم النسخ العكسي M-MuLV (خالٍ من RNase H) قادر على توليد cDNA يزيد طوله عن 10 كيلوبايت حتى 48 درجة مئوية. س: هل المعالجة بـ RNase H ضرورية قبل تضخيم PCR؟ ج: بالنسبة لمعظم تفاعلات RT-PCR، لا تتطلب المعالجة بـ RNase H. ولكن بالنسبة لبعض النواتج المضخمة الصعبة أو التحليلات الحساسة، أضف وحدتين من RNase H من الإشريكية القولونية إلى التفاعل وحضّنه عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. س: هل يمكن استخدام منتجات cDNA في تحليل PCR في الوقت الحقيقي؟ ج: نعم. يمكن استخدام منتجات cDNA الناتجة عن إنزيم النسخ العكسي ProtoScript II مباشرةً لتحليل PCR في الوقت الحقيقي. س: ما هو بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة الذي يمكن استخدامه في PCR بعد تخليق cDNA؟ ج: بالنسبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) اللاحق، نوصي باستخدام OneTaq 2X Master Mix (NEB #M0482 أو M0485) للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل حتى 5 كيلوبايت، أو Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0494) للحصول على أعلى دقة، أو LongAmp Taq 2X Master Mix (NEB #M0287) للحصول على إنتاجية عالية من المنتجات الأطول. س: كيف أختار بين إنزيم النسخ العكسي Induro ومنتجات LunaScript وProtoScript المختلفة؟ ج: إنزيم النسخ العكسي Induro هو إنزيم نسخ عكسي مشفر بواسطة إنترون من المجموعة الثانية، وهو مفيد لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من النسخ الطويلة، والحمض النووي الريبوزي (RNA) ذي البنية الثانوية القوية، وعينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) التي تحتوي على مثبطات. في المقابل، كواشف LunaScript عبارة عن مخاليط رئيسية. مجموعة LunaScript RT Master Mix Kit (خالية من البادئات) (NEB #E3025) مناسبة لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) بشكل عام. منتجات LunaScript RT SuperMix (NEB #E3010/M3010) مُحسّنة لسير عمل RT-qPCR ثنائي الخطوات، حيث لا تتطلب سوى منتجات cDNA قصيرة. كما تُستخدم LunaScript RT SuperMix في سير عمل تسلسل ARTIC SARS-CoV-2. يوضح هذا الجدول تطبيقات وميزات كل منتج. منتجات النسخ العكسي الفيروسي الرجعي المشفر بالإنترونات: إنزيم النسخ العكسي Induro™ (NEB #M0681)، مجموعة LunaScript® RT SuperMix (NEB #E3010)، مجموعة LunaScript RT SuperMix (NEB #M3010)، مجموعة LunaScript RT Master Mix (NEB #E3025)، مجموعة ProtoScript® II لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الأولى (NEB #E6560). التطبيقات: تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) الطويل، عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) غير النقية، تطبيقات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) (مثل التسلسل المباشر للحمض النووي الريبوزي، وتسلسل الحمض النووي التكميلي (cDNA) طويل القراءة، وتسلسل الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA seq)، الكشف عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) على مرحلتين، بروتوكول قصير. ✓ خيارات مرنة من البادئات، و dNTPs المعدلة ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ مزيج فائق ✓ بروتوكول قصير ✓ صبغة تتبع ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ خيارات مرنة من البادئات ✓ بروتوكول قصير ✓ صبغة تتبع ✓ درجة حرارة تفاعل أعلى ✓ خيارات مرنة من البادئات ✓ تتضمن المجموعة جميع المكونات اللازمة. س: لماذا أحصل على كميات قليلة من cDNA؟ ج: هناك عدة أسباب لانخفاض كمية cDNA. إليك بعض الاقتراحات لتحسين الكمية: تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA) عن طريق الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز أو باستخدام جهاز BioAnalyzer (Agilent). يُعد الحمض النووي الريبوزي السليم عالي النقاء ضروريًا لتخليق cDNA كامل الطول. يجب أن يكون للحمض النووي الريبوزي نسبة امتصاص ضوئي لا تقل عن 1.7 عند 260 نانومتر إلى 280 نانومتر أو رقم RIN أكبر من 8. يمكن إزالة الملوثات مثل EDTA عن طريق الترسيب بالإيثانول متبوعًا بغسل بالإيثانول بنسبة 70%. غوانيدينيوم. يمكن إزالة السكريات المتعددة عن طريق الترسيب باستخدام كلوريد الليثيوم. يمكن إزالة البروتينات الملوثة، مثل البروتيازات، من خلال خطوة تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي الريبوزي أو الاستخلاص بالفينول/الكلوروفورم. يُنصح بزيادة كمية الحمض النووي الريبوزي المستخدم، خاصةً للحمض النووي الريبوزي منخفض الوفرة. س: كيف أعرف ما إذا كان قالب الحمض النووي الريبوزي الخاص بي ذا جودة جيدة؟ ج: يُعد الحمض النووي الريبوزي السليم عالي النقاء ضروريًا لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) كامل الطول. تشير نسبة الامتصاص عند A260/A280 التي تزيد عن 1.7 أو رقم RIN أكبر من 8 على جهاز BioAnalyzer عادةً إلى جودة عالية للحمض النووي الريبوزي.