مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext® FFPE، من شركة نيو إنجلاند بيولابس، E6650S

يُشكّل الحمض النووي المُستخلص من عينات الأنسجة المُثبّتة بالفورمالين والمُضمّنة في البارافين (FFPE) تحدياتٍ عديدة في تحضير المكتبات، بما في ذلك انخفاض كميات المدخلات وتفاوت الضرر الناتج عن التثبيت والتخزين وطرق الاستخلاص. غالبًا ما تُثرى المناطق ذات الأهمية باستخدام مناهج تعتمد على التهجين والتقاط الحمض النووي، وتتطلب هذه العمليات كميات كبيرة من مكتبة الحمض النووي المتنوعة والمتجانسة. الفئات ذات الصلة: الحمض النووي FFPE، مواصفات تحضير مكتبة تسلسل الجيل التالي . المواد المطلوبة (غير المرفقة): 80% إيثانول، ماء خالٍ من النيوكلياز، محلول TE بتركيز 0.1X (1 مليمولار Tris-HCl، درجة الحموضة 8.0، 0.1 مليمولار EDTA)، أنابيب شرائح PCR خالية من DNase وRNase، أوليغومرات NEBNext المتعددة لـ Illumina® (www.neb.com/oligos)، حامل مغناطيسي (NEB #S1515S، Alpaqua® cat. #A001322، أو ما يعادلهما)، جهاز التدوير الحراري Agilent® Bioanalyzer® أو TapeStation® والكواشف والمواد الاستهلاكية المرتبطة به، محلول تخفيف المحول NEB #B1430S أو محلول تخفيف محول NEBNext Unique Dual Index UMI المرفق مع مجموعات الحمض النووي NEBNext Unique Dual Index UMI (NEB). الأسئلة الشائعة (#E7395/E7874/E7876/E7878): س: ما أنواع العينات التي يمكنني استخدامها مع مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext FFPE؟ ج: تتوافق مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext® FFPE مع العينات التالفة، بما في ذلك الحمض النووي المثبت بالفورمالين والمضمن في البارافين (FFPE)، بالإضافة إلى عينات الحمض النووي الأخرى التي تعرضت للتلف من خلال عمليات أخرى. تعتمد هذه الطريقة على تحضير المكتبة باستخدام جزيئات معدلة ذات امتداد 3'-dA، مرتبطة بمحولات تحتوي على امتداد 5'-dT. س: ما كمية المادة الأولية المطلوبة لمجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext FFPE؟ ج: يُوصى باستخدام 5-250 نانوغرام من الحمض النووي المقطّع (مثل التقطيع الصوتي). يُرجى مراجعة NEB #E6655 للاطلاع على نسخة من هذه المجموعة تحتوي على كواشف لإجراء التقطيع الأنزيمي باستخدام NEBNext UltraShear™. س: هل يُوصى باختيار الحجم؟ ج: لا يُنصح باختيار الحجم في هذه العملية، إذ قد يكون فقدان العينة كبيرًا مع العينات شديدة التلف مثل الحمض النووي المُستخلص من عينات FFPE. س: ما هي كمية الإدخال (بالنانوغرام) الموصى بها لتحضير مكتبة قياسية مقابل مكتبة إثراء مستهدفة باستخدام عينات الحمض النووي FFPE؟ ج: يُوصى بكمية إدخال لا تقل عن 100 نانوغرام من الحمض النووي FFPE لتحقيق إنتاجية وتعقيد كافيين للمكتبة من عينات FFPE منخفضة الجودة التي تدخل في عمليات الإثراء المستهدف. ستؤدي كميات الإدخال الأعلى إلى تحسين التعقيد. بالنسبة لتحضير المكتبة القياسية والتسلسل، يمكن استخدام إدخال من 5 إلى 250 نانوغرام، مع تحقيق تعقيد أفضل للمكتبة عند استخدام كميات إدخال أعلى. س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext هذه مع محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB؟ ج: نعم. يجب أن يكون المحول من نوع T overhang، وقد تكون إنتاجية المكتبة النهائية أقل قليلاً من استخدام محولات NEBNext لـ Illumina®. إرشادات الاستخدام (تنطبق هذه الإرشادات على المحولات غير التابعة لشركة NEBNext، والمُرمَّزة بالكامل، وبادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) العالمية P5 وP7): استخدم 2.5 ميكرولتر من المحول. تُستخدم المحولات عادةً بتركيز 15-25 ميكرومولار. يجب تحديد التركيز الأمثل للمحول وتخفيفه تجريبيًا. تخطَّ إضافة المُستقبِل وفترة حضانة المُستقبِل لمدة 15 دقيقة. أضف 3 ميكرولتر من الماء أو محلول TE إلى العينة لتعويض فرق الحجم للخطوة التالية. قد يلزم تعديل ظروف تنظيف خرز العينة مع مُستقبِلات قليلة النوكليوتيدات من موردين آخرين. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام مزيج NEBNext MSTC™ FFPE الرئيسي: استخدم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المُرفقة مع محولات المورد المُستخدمة. لا تستخدم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من نوع NEBNext Index Oligo. س: ماذا أفعل إذا رأيت راسبًا في محلول إصلاح الحمض النووي NEBNext FFPE DNA Repair Buffer v2؟ ج: من الشائع رؤية راسب أبيض في محلول إصلاح الحمض النووي NEBNext FFPE DNA Repair Buffer v2. في هذه الحالة، اترك المزيج حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم الماصة لسحب المحلول عدة مرات لتفتيت الراسب، ثم قم برجّه سريعًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. س: هل ستؤثر معالجة الحمض النووي الخاص بي باستخدام مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE DNA Repair Mix v2، كجزء من مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext FFPE، سلبًا على التفاعل اللاحق؟ ج: لم نلاحظ أي تأثير سلبي لمزيج إصلاح الحمض النووي NEBNext FFPE DNA Repair Mix v2 على معظم التطبيقات اللاحقة. يعمل مزيج الإصلاح فقط على القواعد التالفة والشقوق والفجوات. مع ذلك، لا يُنصح باستخدام هذه الطريقة في دراسات الكشف عن المثيلة. س: ما هي أنواع NEBNext Multiplex Oligos التي يمكن استخدامها مع مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext FFPE؟ ج: مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext FFPE متوافقة مع كلٍ من محول NEBNext المختصر وغير المفهرس المرفق مع مجموعات بادئات NEBNext المفهرسة، ومحولات المعرف الجزيئي الفريد (UMI) ذات الفهرس المزدوج الفريد (UDI) كاملة الطول. للاطلاع على قائمة كاملة بجميع الأوليغومرات المتوافقة، يُرجى مراجعة مخطط اختيار الأوليغومرات المتعددة NEBNext. يُرجى ملاحظة أن الدليل يُفصّل بروتوكولات مختلفة لكل نوع من أنواع المحولات عند استخدامها مع عينات الحمض النووي FFPE. س: هل يُصلح مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE الإصدار 2 الروابط المتشابكة بين الحمض النووي والبروتين؟ ج: لا، لا يُصلح مزيج الإصلاح الروابط المتشابكة بين الحمض النووي والبروتين. س: هل يُصلح مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE الإصدار 2 النهايات 3′ المسدودة؟ ج: نعم، سيُعيد مزيج الإصلاح تكوين النهاية 3′ إلى مجموعة هيدروكسيل إذا كانت هناك انسداد في النهاية 3′. س: هل يُمكن لمزيج إصلاح الحمض النووي FFPE الإصدار 2 إصلاح التلف في كلٍ من الحمض النووي أحادي السلسلة وثنائي السلسلة؟ أم هل يتطلب الأمر وجود الحمض النووي المزدوج كقالب؟ ج: يتطلب نشاط الإصلاح الكامل لمزيج FFPE DNA Repair v2 وجود الحمض النووي المزدوج لعملية البلمرة والربط. مع ذلك، ستُستأصل القواعد التالفة، مثل dU الموجودة في الحمض النووي أحادي السلسلة، أثناء عملية الإصلاح ولن تُدمج في مكتبة التسلسل. س: إذا كان لدي قالب حمض نووي يحتوي على مواقع طفرات (مثل 8-أوكسي غوانين أو سيتوزينات منزوعة الأمين) متجاورة مباشرة على سلسلتين متقابلتين، فهل سيؤدي العلاج بمزيج FFPE DNA Repair v2 إلى حدوث قطع/كسر في السلسلتين؟ ج: لم نختبر إصلاح مواقع الطفرات المتجاورة على السلسلتين المتقابلتين. في هذه الحالة، إذا أُزيلت القاعدتان التالفتان في الوقت نفسه، فقد يحدث كسر في السلسلتين، مما يؤدي إلى تجزئة الحمض النووي. أما إذا كان أحد التفاعلين أسرع من الآخر، ولم يحدثا في الوقت نفسه، فمن المفترض أن يقوم مزيج FFPE DNA Repair v2 بإصلاحهما. س: ما هي أطوال الفجوات التي يمكن إصلاحها باستخدام مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE الإصدار الثاني؟ ج: طول الفجوة غير معروف بدقة. بناءً على خبرتنا، يتراوح بين 5 و10 نيوكليوتيدات.