مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي FFPE من شركة نيو إنجلاند بيولابس، E6655S، NEBNext UltraShear®

يُشكّل الحمض النووي المُستخلص من عينات الأنسجة المُثبّتة بالفورمالين والمُضمّنة في البارافين (FFPE) تحدياتٍ عديدة في تحضير المكتبات، بما في ذلك انخفاض كميات المدخلات وتفاوت الضرر الناتج عن التثبيت والتخزين وطرق الاستخلاص. غالبًا ما تُثرى المناطق ذات الأهمية باستخدام مناهج تعتمد على التهجين والتقاط الحمض النووي، وتتطلب هذه العمليات كميات كبيرة من مكتبة الحمض النووي المتنوعة والمتجانسة. الفئات ذات الصلة: الحمض النووي FFPE، مواصفات تحضير مكتبة تسلسل الجيل التالي . المواد المطلوبة (غير المرفقة): 80% إيثانول، ماء خالٍ من النيوكلياز، محلول TE بتركيز 0.1X (1 مليمولار Tris-HCl، درجة الحموضة 8.0، 0.1 مليمولار EDTA)، أنابيب شرائح PCR خالية من DNase وRNase، أوليغومرات NEBNext المتعددة لـ Illumina® (www.neb.com/oligos)، حامل مغناطيسي (NEB #S1515S، Alpaqua® cat. #A001322، أو ما يعادلهما)، جهاز التدوير الحراري Agilent® Bioanalyzer® أو TapeStation® والكواشف والمواد الاستهلاكية المرتبطة به، محلول تخفيف المحول NEB #B1430S أو محلول تخفيف محول NEBNext Unique Dual Index UMI المرفق مع مجموعات الحمض النووي NEBNext Unique Dual Index UMI (NEB). الأسئلة الشائعة (#E7395/E7874/E7876/E7878): س: ما أنواع العينات التي يمكنني استخدامها مع مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext UltraShear FFPE؟ ج: تتوافق مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext UltraShear FFPE مع العينات التالفة، بما في ذلك الحمض النووي المثبت بالفورمالين والمضمن في البارافين (FFPE). تعتمد طريقة تحضير المكتبة هذه على جزيئات معدلة ذات امتداد 3'-dA ترتبط بمحولات تحتوي على امتداد 5'-dT. س: ما كمية المادة الأولية المطلوبة لمجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext UltraShear FFPE؟ ج: يوصى باستخدام 5-250 نانوغرام من الحمض النووي. يرجى مراجعة NEB #E6650 للحصول على نسخة من هذه المجموعة تحتوي على كواشف لإجراء تحضير المكتبة بعد القص الميكانيكي أو الصوتي. س: عند تحضير العينات باستخدام مجموعة NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kit، هل يمكن أن يكون الحمض النووي المدخل في محاليل تحتوي على EDTA؟ ج: نعم، نوصي بأن يكون الحمض النووي المدخل في محلول Tris-EDTA (TE) بدرجة حموضة 8.0 لهذه المجموعة. بدلاً من ذلك، يمكن تخفيف العينات في محلول Tris بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 8.0، أو محلول TE بتركيز 0.1X، أو الماء. س: هل من الضروري حقًا خلط مزيج إنزيم NEBNext UltraShear قبل الاستخدام؟ ج: نعم، قد يؤدي عدم خلط مزيج إنزيم NEBNext UltraShear إلى نتائج غير متناسقة. س: ما هو وقت التجزئة الأمثل لعينات الحمض النووي FFPE باستخدام مجموعة NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kit؟ ج: بالنسبة لمعظم عينات FFPE المخففة في محلول TE بتركيز 1X (تم التحقق من صحته على عينات DIN من 1.5 إلى 7.0)، يُوصى بالتجزئة لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية للحصول على أفضل إنتاجية وجودة وحجم للمكتبة. قد يلزم تحسين وقت التجزئة لعينات FFPE عالية الجودة (DIN > 7.0). س: هل يُنصح باختيار الحجم؟ ج: لا يُنصح باختيار الحجم في هذه العملية، حيث قد يكون فقدان العينة كبيرًا مع العينات شديدة التلف مثل عينات FFPE DNA. س: ما هي قليل النوكليوتيدات المتعددة NEBNext التي يمكن استخدامها مع مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext UltraShear FFPE DNA؟ ج: تتوافق مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext UltraShear FFPE DNA مع كلٍ من محول NEBNext المختصر وغير المفهرس المرفق مع مجموعات بادئات NEBNext المفهرسة، ومحولات المعرف الجزيئي الفريد (UMI) ذات الفهرس المزدوج (UDI) كاملة الطول. للاطلاع على قائمة كاملة بجميع قليل النوكليوتيدات المتوافقة، يُرجى مراجعة مخطط اختيار قليل النوكليوتيدات المتعددة NEBNext. يُرجى ملاحظة أن الدليل يُفصّل بروتوكولات مختلفة لكل نوع من أنواع المحولات عند استخدامها مع عينات FFPE DNA. س: ما هي كمية المدخلات (بالنانوغرام) الموصى بها لتحضير مكتبة الإثراء القياسية مقابل مكتبة الإثراء المستهدفة باستخدام عينات الحمض النووي FFPE؟ ج: يُوصى بكمية مدخلات لا تقل عن 100 نانوغرام من الحمض النووي FFPE لتحقيق إنتاجية وتعقيد كافيين للمكتبة من عينات FFPE منخفضة الجودة التي تدخل في عمليات الإثراء المستهدفة. ستؤدي كميات المدخلات الأعلى إلى تحسين التعقيد. بالنسبة لتحضير المكتبة القياسية والتسلسل، يمكن استخدام مدخلات من 5 إلى 250 نانوغرام، مع تحقيق تعقيد أفضل للمكتبة باستخدام مدخلات أعلى. س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext هذه مع محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB؟ ج: نعم. يجب أن يكون المحول من نوع T overhang، وقد تكون إنتاجية المكتبة النهائية أقل قليلاً من استخدام محولات NEBNext لـ Illumina®. إرشادات الاستخدام (تنطبق هذه الإرشادات على المحولات غير التابعة لـ NEBNext، والمحولات كاملة الطول ذات الترميز الشريطي، وبادئات PCR العالمية P5 وP7): استخدم 2.5 ميكرولتر من المحول. تُستخدم المحولات عادةً بتركيز 15-25 ميكرومولار. يجب تحديد تركيز المحول الأمثل وتخفيفه تجريبيًا. تخطَّ إضافة المُستقبِل وفترة حضانة المُستقبِل لمدة 15 دقيقة. أضف 3 ميكرولتر من الماء أو محلول TE إلى العينة لتعويض فرق الحجم للخطوة التالية. قد يلزم تعديل ظروف تنظيف خرز العينة مع مُستقبِلات قليلة النوكليوتيدات من موردين آخرين. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام مزيج NEBNext MSTC™ FFPE Master Mix: استخدم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المُرفقة مع محولات المورد المُستخدمة. لا تستخدم بادئات NEBNext Index Oligo PCR. س: هل ستؤثر معالجة الحمض النووي الخاص بي باستخدام مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE v2 كجزء من مجموعة NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kit سلبًا على التفاعل اللاحق؟ ج: لم نلاحظ أي تأثير سلبي لمزيج إصلاح الحمض النووي FFPE v2 من NEBNext على معظم التطبيقات اللاحقة. سيعمل مزيج الإصلاح فقط على القواعد التالفة والشقوق والفجوات. ومع ذلك، لا يُنصح باستخدام سير العمل هذا في دراسات الكشف عن المثيلة. س: هل يُصلح مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE v2 الروابط المتشابكة بين الحمض النووي والبروتين؟ س: هل يُصلح مزيج الإصلاح الروابط المتشابكة بين الحمض النووي والبروتين؟ ج: لا، لا يُصلح مزيج الإصلاح الروابط المتشابكة بين الحمض النووي والبروتين. س: هل يُصلح مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE الإصدار الثاني النهايات 3′ المسدودة؟ ج: نعم، يُعيد مزيج الإصلاح تكوين النهاية 3′ إلى مجموعة هيدروكسيل إذا كانت مسدودة. س: هل يُمكن لمزيج إصلاح الحمض النووي FFPE الإصدار الثاني إصلاح التلف في كلٍ من الحمض النووي أحادي السلسلة وثنائي السلسلة؟ أم أنه يتطلب حمضًا نوويًا ثنائي السلسلة كقالب؟ ج: يتطلب نشاط الإصلاح الكامل لمزيج إصلاح الحمض النووي FFPE الإصدار الثاني وجود حمض نووي ثنائي السلسلة للبلمرة والربط. مع ذلك، ستُستأصل القواعد التالفة، مثل dU الموجودة في الحمض النووي أحادي السلسلة، أثناء الإصلاح ولن تُدمج في مكتبة التسلسل. س: إذا كان لدي قالب حمض نووي يحتوي على مواقع طفرات (مثل 8-أوكسي غوانين أو سيتوزينات منزوعة الأمين) متجاورة مباشرةً على سلسلتين متقابلتين، فهل سيؤدي العلاج بمزيج إصلاح الحمض النووي FFPE الإصدار الثاني إلى حدوث قطع/كسر في السلسلتين؟ ج: لم نختبر إصلاح مواقع الطفرات المتجاورة على السلاسل المتقابلة. في هذه الحالة، إذا أُزيلت القاعدتان التالفتان في الوقت نفسه، فقد يحدث كسر في السلسلتين، مما يؤدي إلى تفتت الحمض النووي. أما إذا كان أحد التفاعلين أسرع من الآخر، ولم يحدثا في الوقت نفسه، فمن المفترض أن يقوم مزيج FFPE DNA Repair v2 بإصلاحهما. س: ما هي أطوال الفجوات التي يمكن إصلاحها باستخدام مزيج FFPE DNA Repair v2؟ ج: طول الفجوة غير معروف بدقة. بناءً على خبرتنا، يتراوح بين 5 و10 نيوكليوتيدات. س: هل يمكنني تفتيت عينة الحمض النووي الجينومي باستخدام NEBNext UltraShear® في محاليل منظمة أخرى غير 1X TE (10 مليمولار Tris pH 8.0، 1 مليمولار EDTA)؟ ج: يمكن تجزئة عينات الحمض النووي الجينومي (gDNA) باستخدام جهاز NEBNext UltraShear® مع محاليل الإذابة الشائعة في مجموعات استخلاص الحمض النووي الجينومي، مثل محلول الإذابة Monarch® DNA Elution Buffer، ومحلول الإذابة Monarch® gDNA Elution Buffer، ومحلول الإذابة Monarch® gDNA Elution Buffer II، ومحلول الإذابة EB، ومحلول الإذابة AE، بدلاً من محلول TE 1X ذي الرقم الهيدروجيني 8.0. مع ذلك، تكون عملية التجزئة أبطأ باستخدام جهاز NEBNext UltraShear مع عينات الحمض النووي الجينومي المُجزأة في محاليل الإذابة هذه. لذا، يلزم تحسين ظروف التجزئة، وقد يتطلب الأمر حضانة العينات لفترات أطول عند درجة حرارة 37 أو 45 درجة مئوية مقارنةً بعينات الحمض النووي الجينومي المُجزأة في محلول TE 1X ذي الرقم الهيدروجيني 8.0. محلول استخلاص الحمض النووي Monarch® (NEB #T1016): 10 ملي مولار تريس، 0.1 ملي مولار إيدتا، درجة الحموضة 8.5. محلول استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® (NEB #T3016): 10 ملي مولار تريس، 0.1 ملي مولار إيدتا، درجة الحموضة 9.0. محلول استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® II (NEB #T3056) أو المحلول AE: 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 0.5 ملي مولار إيدتا، درجة الحموضة 9.0. محلول Qiagen EB: 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، درجة الحموضة 8.5.