Product Description
الفئات ذات الصلة : PURExpress® تخليق البروتين في المختبر، التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا، تطبيقات التعبير عن البروتين PURExpress، حلول الاستنساخ والأتمتة عالية الإنتاجية، التعبير عن البروتين السام، الأسئلة الشائعة : س: عند استخدام PURExpress، لم أتمكن من تخليق بروتين التحكم؟ ج: تم تعطيل مكونات المجموعة. يلزم تخزين جميع المواد عند درجة حرارة -80 درجة مئوية، ويجب تقليل عدد دورات التجميد والذوبان. تلوث النيوكلياز: لتجنب تلوث النيوكلياز، ارتدِ قفازات واستخدم رؤوسًا وأنابيب خالية من النيوكلياز. نوصي أيضًا بإضافة مثبط RNase (مثل NEB #M0314) إلى التفاعلات. س: عند استخدام PURExpress، تمكنت من تخليق بروتين التحكم، ولكن العينة المستهدفة غير موجودة أو موجودة بكمية قليلة؟ ج: تلوث RNase. تُعد مجموعات التحضير المصغرة التجارية أداة مفيدة لتحضير قالب الحمض النووي، ولكنها غالبًا ما تكون مصدرًا لإدخال RNase A إلى تفاعل تخليق البروتين في المختبر. غالبًا ما يُسهم استخدام مثبط إنزيم RNase (NEB #M0314S، 20 وحدة/25 ميكرولتر من حجم التفاعل) في التغلب على هذه المشكلة. يجب التأكد من صحة تسلسل الحمض النووي القالب، حيث ينبغي أن تكون المنطقة المشفرة والتسلسلات التنظيمية صحيحة ومتوافقة مع الإطار لضمان بدء الترجمة بشكل سليم وإنتاج بروتين كامل الطول. قد تؤثر التسلسلات التنظيمية غير المثلى و/أو التباعد غير المناسب سلبًا على كفاءة الترجمة. يُعد بدء الترجمة خطوة أساسية لنجاح عملية تخليق البروتين. قد يؤدي وجود بنية ثانوية أو كودونات نادرة في بداية الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) إلى إعاقة عملية البدء والتأثير سلبًا على تخليق البروتين. قد يُساعد إضافة منطقة بدء جيدة (مثل أول عشرة كودونات من بروتين ربط المالتوز)، بشرط أن يكون إضافة الأحماض الأمينية إلى التسلسل المستهدف مقبولًا. بدلاً من ذلك، يُمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتعديل الطرف 5' من الجين المستهدف كاستراتيجية ناجحة للتخلص من العناصر البنيوية الثانوية أو الكودونات النادرة. قد يكون الحمض النووي القالب ملوثًا بمثبطات النسخ أو الترجمة. يمكن الكشف عن وجود هذه المثبطات من خلال تجربة خلط بسيطة (حمض نووي ضابط + حمض نووي مستهدف، مقارنةً بالحمض النووي الضابط وحده). يؤدي وجود هذه المثبطات في الحمض النووي المستهدف إلى تقليل كمية البروتين الضابط. تجنب استخدام الحمض النووي المنقى من هلام الأغاروز، لأنه غالبًا ما يحتوي على مثبطات للترجمة (مثل بروميد الإيثيديوم). يُعدّ كبريتات دوديسيل الصوديوم المتبقية من بروتوكولات تحضير البلازميد ملوثًا شائعًا آخر، ويمكن إزالتها عن طريق استخلاص الفينول:الكلوروفورم والترسيب بالإيثانول. عند إجراء الترسيب بالإيثانول، نوصي باستخدام أسيتات الصوديوم بدلًا من أسيتات الأمونيوم، وهو مثبط معروف للترجمة. احرص على إزالة جميع آثار الإيثانول. يجب أن تكون القوالب الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) خالية من نواتج التضخيم غير النوعية. قد تحتوي هذه الملوثات على إشارات نسخ، وبالتالي تتنافس على مكونات النسخ و/أو الترجمة وتستنزفها. نتيجةً لذلك، قد تتأثر الكمية الناتجة، وقد تُنتج نواتج مبتورة غير مرغوب فيها. تركيز الحمض النووي القالب ليس مثاليًا. يُعد تركيز الحمض النووي القالب مهمًا لأن تخليق البروتين في المختبر يعتمد على توازن بين النسخ والترجمة. يؤدي نقص الحمض النووي القالب إلى تقليل كمية الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المُترجم بنشاط، بينما يؤدي فرط تركيزه إلى إنتاج كميات زائدة من mRNA وإرهاق جهاز الترجمة. نوصي باستخدام 250 نانوغرام من الحمض النووي القالب لتفاعل حجمه 25 ميكرولتر. قد يُحسّن استخدام كميات مختلفة من الحمض النووي القالب (مثلًا من 25 إلى 1000 نانوغرام) من إنتاجية بروتين مُستهدف مُحدد. إذا تم استخدام امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لحساب تركيز الحمض النووي القالب، فضع في اعتبارك أن الحمض النووي الريبوزي (RNA) أو الحمض النووي الصبغي يمتص أيضًا الأشعة فوق البنفسجية. إذا كانت عينتك تحتوي على كميات كبيرة من الحمض النووي الريبوزي أو الحمض النووي الصبغي، فقد تكون الكمية الفعلية للحمض النووي القالب أقل من الكمية المحسوبة. يجب أن تكون نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى 280 نانومتر 1.8. قد يكشف تشغيل جزء من الحمض النووي القالب على هلام الأغاروز عن وجود أحماض نووية أخرى، بالإضافة إلى أي تحلل أو حجم غير صحيح للحمض النووي القالب. س: عند استخدام PURExpress، تمكنتُ من تصنيع البروتين المستهدف، لكن المنتج كامل الطول ليس النوع السائد؟ ج: بدء الترجمة و/أو إنهاؤها غير صحيحين. يتطلب إنتاج البروتين كامل الطول بدءً وإنهاءً صحيحين. يمكن أن تؤدي مواقع دخول الريبوسوم الداخلية و/أو الإنهاء المبكر إلى إنتاج بروتينات مبتورة غير مرغوب فيها. يصعب التحكم في بدء الترجمة عند كودونات AUG غير الأصلية والإنهاء المبكر. إذا وُجدت العديد من الكودونات النادرة أو كان البروتين المستهدف يحتوي على نسبة عالية بشكل غير عادي من حمض أميني معين، فقد يساعد إضافة الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA) "المفقود". س: أين يمكنني العثور على المزيد من الأسئلة الشائعة المفصلة حول PURExpress؟ ج: انقر هنا للاطلاع على المجموعة الكاملة من الأسئلة الشائعة حول PURExpress. س: هل توجد مراجع لـ PURExpress؟ ج: نعم. يمكنك العثور على مراجع PURExpress هنا.
Order Guidelines
1. Price & Stock Available on Request. Click to send email to: service@iright.com
2. Please DO NOT make payment before confirmation.
3. Minimum order value of $1,000 USD required.
Collaboration
Tony Tang
Email: Tony.Tang@iright.com
Mobile/WhatsApp/Wechat: +86-17717886924