مجموعة نيو إنجلاند بيولابس، E6840S، PURExpress® Δ (aa, tRNA)

الفئات ذات الصلة بـ PURExpress®: تخليق البروتين في المختبر، التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا، تطبيقات التعبير عن البروتين. PURExpress®، التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا، مواصفات التعبير عن البروتين. المواد المطلوبة (غير المرفقة) : عام: حاضنة 37 درجة مئوية. الوسم: ميثيونين-35S (يوصى بـ >1000 كوري/مليمول، درجة ترجمة في المختبر). ترسيب TCA: محاليل TCA (25%، 10%)، هيدروكسيد الصوديوم 1 مولار، أحماض أمينية، إيثانول، مرشحات ألياف زجاجية، مشعب ترشيح فراغي. SDS-PAGE: هلامات ومحلول تشغيل، جهاز هلام، مصدر طاقة، مجفف هلام. Western Blotting: جهاز نقل، غشاء، أجسام مضادة وكاشف كشف. التنقية: Ni-NTA Agarose، Amicon Ultra- 0.5 مل، مرشحات طرد مركزي غشائية Ultracel- 100K. الأسئلة الشائعة : س: كيف تعمل مجموعة Δ aa Δ tRNA؟ هل يختلف طقم E6840S عن طقم PURExpress E6800S؟ ج: يتم توفير الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA) والأحماض الأمينية بشكل منفصل في هذا الطقم، مما يسمح للمستخدمين بإجراء تفاعل تخليق البروتين عن طريق إضافة مزيج من الأحماض الأمينية والحمض النووي الريبوزي الناقل المعدل إلى التفاعل. لمزيد من المعلومات حول الاستخدام، يُرجى الرجوع إلى دليل المنتج. س: عند استخدام PURExpress، لم أتمكن من تخليق بروتين التحكم؟ ج: تم تعطيل مكونات الطقم. يلزم تخزين جميع المواد عند درجة حرارة -80 درجة مئوية، ويجب تقليل عدد دورات التجميد والذوبان. تلوث النيوكلياز: لتجنب تلوث النيوكلياز، ارتدِ قفازات واستخدم رؤوسًا وأنابيب خالية من النيوكلياز. نوصي أيضًا بإضافة مثبط RNase (مثل NEB #M0314) إلى التفاعلات. س: عند استخدام PURExpress، تمكنت من تخليق البروتين المستهدف، ولكن المنتج كامل الطول ليس النوع السائد؟ ج: بدء و/أو إنهاء الترجمة غير صحيح. يتطلب إنتاج البروتين كامل الطول بدء وإنهاءً صحيحين. قد تؤدي مواقع دخول الريبوسوم الداخلية و/أو الإنهاء المبكر إلى إنتاج بروتينات مبتورة غير مرغوب فيها. يصعب التحكم في بدء الترجمة عند كودونات AUG غير الأصلية والإنهاء المبكر. في حال وجود العديد من الكودونات النادرة أو احتواء الهدف على نسبة عالية بشكل غير معتاد من حمض أميني معين، فقد يساعد إضافة الحمض النووي الريبوزي الناقل "المفقود". س: عند استخدام PURExpress، تمكنتُ من تصنيع البروتين المرجعي، ولكن عينة الهدف غير موجودة أو موجودة بكمية قليلة؟ ج: تلوث RNase. تُعد مجموعات التحضير المصغرة التجارية أداة مفيدة لتحضير قالب الحمض النووي، ولكنها غالبًا ما تكون مصدرًا لإدخال RNase A إلى تفاعل تخليق البروتين في المختبر. غالبًا ما يؤدي تضمين مثبط RNase (NEB #M0314S، 20 وحدة/25 ميكرولتر من التفاعل) إلى التغلب على هذه المشكلة. تصميم قالب الحمض النووي غير سليم. تأكد من صحة تسلسل قالب الحمض النووي. يجب أن تكون منطقة الترميز والتسلسلات التنظيمية صحيحة ومتوافقة مع الإطار لضمان بدء الترجمة بشكل سليم وإنتاج بروتين كامل الطول. قد تؤثر التسلسلات التنظيمية غير المثلى و/أو التباعد غير المناسب سلبًا على كفاءة الترجمة. يُعد بدء الترجمة خطوة أساسية لنجاح تخليق البروتين. قد يؤدي وجود بنية ثانوية أو كودونات نادرة في بداية الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) إلى إعاقة عملية البدء والتأثير سلبًا على تخليق البروتين. قد يساعد إضافة منطقة بدء جيدة (مثل أول عشرة كودونات من بروتين ربط المالتوز)، بافتراض إمكانية تحمل إضافة بقايا إلى التسلسل المستهدف. بدلاً من ذلك، يمكن أن يكون استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتعديل الطرف 5' من الجين المستهدف استراتيجية ناجحة للتخلص من العناصر البنيوية الثانوية أو الكودونات النادرة. قد يكون الحمض النووي القالب ملوثًا، وقد توجد مثبطات النسخ أو الترجمة فيه. ستكشف تجربة خلط بسيطة (حمض نووي ضابط + حمض نووي مستهدف، مقارنةً بالحمض النووي الضابط وحده) ما إذا كانت المثبطات موجودة. ستؤدي المثبطات الموجودة في الحمض النووي المستهدف إلى تقليل إنتاج البروتين الضابط. لا تستخدم الحمض النووي المستخلص من هلام الأغاروز، لأنه غالبًا ما يحتوي على مثبطات للترجمة (مثل بروميد الإيثيديوم). يُعدّ كبريتات دوديسيل الصوديوم المتبقية من بروتوكولات تحضير البلازميد ملوثًا شائعًا آخر، ويمكن إزالتها عن طريق استخلاص الفينول:الكلوروفورم والترسيب بالإيثانول. عند إجراء الترسيب بالإيثانول، نوصي باستخدام أسيتات الصوديوم بدلًا من أسيتات الأمونيوم، وهو مثبط معروف للترجمة. احرص على إزالة جميع آثار الإيثانول. يجب أن تكون القوالب المُنتجة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) خالية من نواتج التضخيم غير النوعية. قد تحتوي هذه الملوثات على إشارات النسخ، وبالتالي تتنافس على مكونات النسخ و/أو الترجمة وتستنزفها. نتيجةً لذلك، قد تتأثر كمية الناتج، وقد تُنتج منتجات مبتورة غير مرغوب فيها. تركيز الحمض النووي القالب ليس مثاليًا. يُعدّ تركيز الحمض النووي القالب مهمًا لأن تخليق البروتين في المختبر هو توازن بين النسخ والترجمة. يؤدي نقص القالب إلى تقليل كمية الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المُترجم بنشاط، بينما يؤدي فرط القالب إلى الإفراط في إنتاج الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) وإرهاق جهاز الترجمة. نوصي باستخدام 250 نانوغرام من الحمض النووي القالب لتفاعل حجمه 25 ميكرولتر. قد يؤدي استخدام كميات مختلفة من الحمض النووي القالب (مثلًا من 25 إلى 1000 نانوغرام) إلى تحسين إنتاجية بروتين مستهدف معين. إذا تم استخدام امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لحساب تركيز الحمض النووي القالب، فاعلم أن الحمض النووي الريبي (RNA) أو الحمض النووي الصبغي يمتص أيضًا الأشعة فوق البنفسجية. إذا كانت عينتك تحتوي على كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الصبغي، فقد تكون الكمية الفعلية للحمض النووي القالب أقل من الكمية المحسوبة. يجب أن تكون نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى 280 نانومتر 1.8. قد يكشف تشغيل جزء من الحمض النووي القالب على هلام الأغاروز عن وجود أحماض نووية أخرى، بالإضافة إلى أي تحلل أو حجم غير صحيح للحمض النووي القالب. س: أين يمكنني العثور على المزيد من الأسئلة الشائعة المفصلة حول PURExpress؟ ج: انقر هنا للاطلاع على المجموعة الكاملة من الأسئلة الشائعة حول PURExpress. س: هل توجد مراجع لـ PURExpress؟ ج: نعم. يمكنك العثور على مراجع PURExpress هنا.