مجموعة أدوات IMPACT™ من شركة نيو إنجلاند بيولابس، E6901S

نظام IMPACT™ (التنقية بوساطة الإنتين باستخدام علامة ربط الكيتين ذات الألفة) هو نظام جديد لتنقية البروتينات، يستخدم خاصية الانقسام الذاتي المحفز لعناصر ربط البروتين، والتي تُسمى الإنتينات، لفصل البروتين المستهدف عن علامة الألفة. الفئات ذات الصلة : نظام IMPACT، التعبير عن البروتين في بكتيريا الإشريكية القولونية، التنقية بالألفة، تطبيقات التنقية بالألفة وعلامات التعبير، تنقية البروتين، علامة الألفة IMPACT، الأسئلة الشائعة : س: ما الأنظمة التي تقدمها NEB للتعبير عن البروتين وتنقيته؟ ج: يستفيد نظام NEBExpress® MBP Fusion and Purification (NEB# E8201) من مُحفز Ptac القوي وإشارات بدء الترجمة لبروتين ربط المالتوز (MBP) لتعزيز ذوبان ومستويات التعبير عن البروتين المطلوب في بكتيريا الإشريكية القولونية. المنتج الناتج هو بروتين اندماجي MBP، والذي يُنقى ويُعزل في خطوتين بسيطتين: الاستخلاص بالأميلوز متبوعًا بفصل البروتين بواسطة إنزيم TEV وعزله باستخدام راتنج النيكل، مما ينتج عنه بروتين مستهدف عالي النقاء وخالٍ من العلامات. يستخدم نظام IMPACT™ (NEB# E6901) عناصر ربط بروتينية مُهندسة (إنتينات) لتنقية البروتينات المُعاد تركيبها باستخدام عمود تقارب واحد للكيتين. يتميز هذا النظام عن أنظمة اندماج البروتينات الأخرى بقدرته على فصل البروتين المُعاد تركيبه عن علامة التقارب دون استخدام إنزيم بروتياز. بالإضافة إلى ذلك، يمكن عزل البروتينات المُعاد تركيبها الأصلية التي تحتوي على ثيوإستر في الطرف الكربوكسيلي لتطبيقات مثل التخليق الجزئي للبروتينات ووضع العلامات الموضعية. توفر مجموعة K.lactis Protein Expression Kit (NEB# E1000) طريقة سهلة للتعبير عن جين مُحدد في خميرة Kluyveromyces lactis. يمكن إنتاج البروتينات داخل الخلايا أو إفرازها باستخدام ناقل التعبير التكاملي pKLAC1 المرفق. مجموعة PURExpress® لتخليق البروتين في المختبر (NEB# E6800) هي نظام نسخ/ترجمة خالٍ من الخلايا لبكتيريا الإشريكية القولونية، مُعاد تكوينه من مكونات مُنقّاة. عوامل النسخ/الترجمة في الإشريكية القولونية (باستثناء الريبوسومات) مُوسومة بالهيستيدين. يمكن التعبير عن البروتين المستهدف من قوالب الحمض النووي الخطي أو البلازميدي التي تحتوي على مُحفّز T7. نظام NEBExpress™ لتخليق البروتين الخالي من الخلايا لبكتيريا الإشريكية القولونية (NEB #E5360) هو نظام قائم على المستخلصات مُشتق من خلايا الإشريكية القولونية، تم هندسته لإنتاج البروتين المُعاد تركيبه بكميات كبيرة في المختبر من جينات مُستنسخة أسفل مُحفّز T7 في قوالب الحمض النووي الخطي أو البلازميدي. يمكن عزل البروتين المستهدف المؤتلف بكفاءة باستخدام خرزات NEBExpress المغناطيسية Ni-NTA (NEB #S1423)، أو أعمدة الطرد المركزي (NEB #S1427)، أو الراتنج (NEB #S1428). تُعدّ خرزات NEBExpress™ المغناطيسية Ni-NTA (NEB #S1423)، وأعمدة الطرد المركزي NEBExpress™ Ni (NEB #S1427)، وراتنج NEBExpress™ Ni (NEB #S1428) مجموعة من منتجات النيكل المُثبّتة لعزل البروتينات المُوسومة بالهيستيدين المتعدد (His-tagged) من مُستخلصات الخلايا أو تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا. س: ما هو IMPACT؟ ج: IMPACT، وهو اختصار لـ Intein-Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag، هو نظام جديد لتنقية البروتينات يسمح بتنقية البروتينات المؤتلفة دون الحاجة إلى وسم تقارب في خطوة كروماتوغرافية واحدة. طُوِّرت هذه الطريقة في مختبرات نيو إنجلاند بيولابس (NEB) استنادًا إلى دراسات آلية ربط البروتينات (انظر المراجع في 1.10 و1.11). وتتميز هذه الطريقة عن جميع أنظمة التنقية الأخرى بقدرتها على تنقية البروتين المُعاد تركيبه بتسلسله الأصلي باستخدام عمود تقارب واحد، دون الحاجة إلى استخدام إنزيم بروتياز. يعتمد نظام IMPACT على خاصية التحلل الذاتي المُحفَّز لعنصر ربط بروتيني مُهندس (إنتين) لفصل البروتين المستهدف عن علامة التقارب. يُدمج البروتين المستهدف مع علامة تتكون من الإنتين ونطاق ربط الكيتين (CBD)، مما يسمح بتنقية البروتين المُدمج الأولي باستخدام عمود الكيتين. يخضع الإنتين لتحلل نوعي بواسطة كاشف ثيول أو بتغيير درجة الحموضة ودرجة الحرارة، مما يُحرر البروتين المستهدف من علامة الكيتين المرتبطة به، وبالتالي يُنتج البروتين المستهدف من خلال عمود واحد. يتضمن نظام IMPACT سلسلة من نواقل التعبير في بكتيريا الإشريكية القولونية، والتي تستخدم إنترونات مُهندسة تتكون من 134 إلى 454 حمضًا أمينيًا. صُممت هذه النواقل للتعبير عن البروتينات وتنقيها في بكتيريا الإشريكية القولونية، بالإضافة إلى عمليات معالجة البروتينات مثل وسم البروتينات وربطها وتكوين الحلقات. تتوفر مجموعة IMPACT، بالإضافة إلى النواقل التي تُباع بشكل منفصل، لتلبية أهداف بحثك. يتيح توافق مواقع الاستنساخ المتعددة في النواقل إمكانية إدخال نفس جزء الجين المستهدف في نواقل مختلفة لتحقيق التعبير الأمثل والتنقية. يُدرج الجين المُشفّر للبروتين المستهدف في موقع الاستنساخ المتعدد لناقل التعبير IMPACT، لتكوين اندماج متوافق بين الجين المستهدف وعلامة التقارب المكونة من الإنتين ونطاق ربط الكيتين (CBD، 52 حمضًا أمينيًا). عند تمرير المستخلصات الخام لخلايا الإشريكية القولونية المُحفّزة عبر عمود الكيتين، يرتبط بروتين الاندماج (إنتين-CBD) بحبيبات الكيتين، بينما تُغسل جميع الملوثات الأخرى من العمود. يُحفّز الانقسام على العمود عند درجة حرارة 4 مئوية بإضافة عامل مُختزل (مثل DTT) أو بتغيير درجة الحرارة ودرجة الحموضة (باستخدام نواقل pTWIN). يُحرر البروتين المستهدف بينما تبقى علامة الإنتين-CBD مرتبطة بالعمود، مما يؤدي إلى تنقية البروتين المستهدف باستخدام عمود واحد. تحتوي مجموعة IMPACT على نواقل تعبير تسمح بدمج علامة الإنتين القابلة للفصل إما مع الطرف الكربوكسيلي (pTXB1) أو الطرف الأميني (pTYB11) للبروتين المستهدف. هذه المرونة في بناء البروتين المدمج تزيد من احتمالية نجاح التعبير عن البروتين المستهدف وتنقيته. توفر متجهات pTWIN (#N6951S و#N6952S) العديد من المزايا: (1) سهولة عزل البروتينات الأصلية دون استخدام كاشف ثيول - باستخدام تغيير درجة الحموضة ودرجة الحرارة (إنتين 1)؛ (2) عزل البروتينات التي تحتوي على سيستين في الطرف الأميني [لربط الإنتين بوساطة (IPL)] أو بقايا أخرى غير الميثيونين دون استخدام بروتيازات خارجية قد تكون مكلفة وغير نوعية؛ (3) تنقية البروتينات التي تحتوي على ثيوإستر في الطرف الكربوكسيلي لاستخدامها في تفاعلات IPL التي يمكنها إدخال أحماض أمينية غير مشفرة في البروتين أو وسم بروتين مُعبَّر عنه بكتيريًا؛ (4) توليد أنواع بروتينية دائرية. تستخدم جميع المتجهات مُحفِّز T7 وجين lacI لتوفير تحكم دقيق في التعبير عن جين الاندماج. يؤدي ارتباط مثبط اللاكتوز بتسلسل مُشغِّل اللاكتوز الموجود مباشرةً بعد مُحفِّز T7 إلى كبح التعبير القاعدي لجين الاندماج في غياب تحفيز IPTG. تحمل جميع النواقل علامة جين Ampr (جين bla)، الذي ينقل مقاومة الأمبيسيلين إلى السلالة المضيفة، باستثناء pKYB1 (#N6706S)، الذي يحمل جين مقاومة الكاناميسين. س: ما هي مزايا نظام IMPACT؟ أ: تنقية أحادية العمود - لا تتطلب خطوات إضافية لإزالة علامة التقارب. ينتج عنها تسلسل الأحماض الأمينية الأصلي. يتم دمج البروتين المستهدف مع الطرف الكربوكسيلي أو الطرف الأميني لعلامة الإنتين. لا حاجة إلى البروتيازات لإزالة علامة التقارب من البروتين المستهدف. يتم استخدام كاشف الثيول أو تغيير درجة الحموضة ودرجة الحرارة لتحفيز الانقسام على العمود. عزل البروتينات مع أو بدون بقايا ميثيونين في الطرف الأميني. إنتاج بروتينات تحتوي على سيستين في الطرف الأميني و/أو ثيوإستر في الطرف الكربوكسيلي لاستخدامها في وسم البروتين وربطه وتكوين الحلقات [انظر الجزء 6: التطبيقات: ربط البروتين ووسمه]. محفز T7 للتعبير عالي المستوى والتنظيم الدقيق للنسخ. التخليق الجزئي للبروتين - القدرة على إنشاء ثيوإستر في الطرف الكربوكسيلي للربط مع ببتيد أو علامة تحتوي على سيستين في الطرف الأميني [انظر الجزء 6: التطبيقات: ربط البروتين ووسمه]. تتيح إمكانية وسم الطرف الكربوكسيلي للبروتين المستهدف [انظر الجزء 6: التطبيقات: ربط البروتينات ووسمها]، تحتوي متجهات IMPACT pTYB21 (NEB #N6709) وpTYB22 (NEB #N6710) على موقع ربط متعدد (MCS) متوافق مع متجهات التعبير الأخرى من NEB. س: ما هي المتجهات المضمنة في مجموعة IMPACT؟ ج: تتضمن مجموعة IMPACT ثلاثة متجهات تعبير لبكتيريا الإشريكية القولونية، مما يسمح بدمج وسم الإنتين القابل للفصل إما مع الطرف الكربوكسيلي (pTXB1) أو الطرف الأميني (pTYB11) للبروتين المستهدف. يعمل المتجه pTXB10 كعنصر تحكم إيجابي للتعبير والتنقية، ويمكن استخدامه أيضًا كمتجه استنساخ. 1.9 ... يتم دمج البروتين المستهدف في نهايته C مع علامة إنتين ذاتية الانقسام (~28 كيلو دالتون) تحتوي على مجال ربط الكيتين (CBD، 6 كيلو دالتون) مما يسمح بتنقية السلائف المدمجة عن طريق التقارب على عمود الكيتين. يستخدم ناقل pTYB11 (#N6701S) إنتينًا من جين VMA1 الخاص بخميرة Saccharomyces cerevisiae (إنتين Sce VMA1؛ 454 حمضًا أمينيًا) (Chong, S. et al. (1998) استخدام نشاط الانقسام الطرفي C لعنصر ربط البروتين لتنقية البروتينات المؤتلفة في خطوة كروماتوغرافية واحدة. Nucl. Acids Res. 26, 5109–5115; Chong, S., et al. (1998) تعديل ربط البروتين لإنتين ATPase الغشائي الفجوي لخميرة Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 273, 10567–77). يتم دمج البروتين المستهدف في طرفه الأميني مع علامة VMA1 intein-CBD ذاتية الانقسام (56 كيلو دالتون). تتيح هذه العلامة تنقية البروتين الأولي المدمج باستخدام عمود الكيتين. صُمم الناقل لتنقية البروتين المستهدف دون أي أحماض أمينية إضافية، أو دون بقايا ميثيونين في الطرف الأميني، وذلك عن طريق استنساخ طرفه 5' في موقع SapI. يحمل ناقل التحكم، pMXB10 (#N6903S)، المشتق من pTXB1، البروتين المستهدف، وهو بروتين ربط المالتوز (MBP)، مُدرجًا مسبقًا في اتجاه 5' من نطاق ربط الكانابينويد (CBD) الخاص بـ Mxe GyrA. يؤدي التحفيز إلى إنتاج بروتين MBP-GyrA المدمج، والذي عند فصله، ينتج عنه فصل MBP. يمكن استخدام مناطق الربط المتعددة المحيطة بالمنطقة المشفرة لـ MBP بسهولة لاستنساخ جين مُحدد. مع ذلك، بعد فصل الإنتين، سيحتوي البروتين المستهدف على أحماض أمينية إضافية في طرفه الكربوكسيلي، بما في ذلك (LEY)، الذي يتميز بنسبة فصل ناجحة عالية. تستخدم نواقل IMPACT مُحفِّز T7 لتوفير تحكم دقيق في التعبير عن جين الاندماج في بكتيريا الإشريكية القولونية (Dubendorff, JW and Studier, FW (1991) Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219, 45–59). تحمل نواقل IMPACT علامة جين Ampr (جين bla)، الذي يُكسب السلالة المضيفة مقاومة للأمبيسيلين؛ أحد النواقل، pKYB1 (#N6706S)، مقاوم للكاناميسين (متوفر بشكل منفصل). س: إذا كان البروتين المستهدف حساسًا لـ DTT، فأي ناقل (نواقل) يجب أن أستخدم؟ ج: يمكنك استخدام الناقل pTWIN1 أو pTWIN2. يسمح دمج علامة الإنتين (Intein 1) مع الطرف الأميني للبروتين المستهدف بتنقية البروتين في عمود واحد مع تغيير في درجة الحموضة ودرجة الحرارة. لا تتطلب عملية الفصل استخدام كواشف الثيول. يمكن دمج الطرف الأميني (N-terminus) للبروتين المستهدف مع الطرف الكربوكسيلي (C-terminus) لإنزيم الإنتين 1 (Intein1) في نواقل pTWIN (إنزيم الإنتين Ssp DnaB). يُسهّل نطاق ربط الكيتين (CBD)، الموجود في الطرف الأميني لإنزيم الإنتين Ssp DnaB، عملية التنقية باستخدام راتنج الكيتين. تم استبدال السيستين الأميني (Cys1) في الإنتين بالألانين لمنع تفاعل الربط. يخضع إنزيم الإنتين Ssp DnaB المُعدّل لهذه الطفرة لفصل رابطة الببتيد بين الطرف الكربوكسيلي للإنتين والحمض الأميني التالي، وذلك تبعًا لدرجة الحرارة ودرجة الحموضة. يحدث هذا الفصل من خلال تكوين حلقة سكسينيميد في السلسلة الجانبية للأسباراجين الكربوكسيلي، مصحوبًا بكسر رابطة الببتيد. س: ما هو ربط البروتين بوساطة الإنتين (IPL)؟ ج: يسمح تفاعل IPL بربط ببتيد اصطناعي أو بروتين يحتوي على بقايا سيستين في الطرف الأميني (N-terminal) بالطرف الكربوكسيلي (C-terminal) لبروتين مُعبَّر عنه بكتيريًا عبر رابطة ببتيدية طبيعية [Evans et al., (1998) Protein Sci.7, 2256-2264]. يستخدم بروتوكول IPL نواقل الاندماج الطرفية الكربوكسيلية IMPACT للتعبير عن البروتين المطلوب وتنقيته، ولتكوين رابطة ثيوإستر في طرفه الكربوكسيلي. نوصي باستخدام pTXB1 لتفاعل IPL كلما أمكن ذلك. يطبق تفاعل IPL الكيمياء الموصوفة لـ "الربط الكيميائي الطبيعي" الذي يدمج ببتيدين اصطناعيين عندما يهاجم السيستين الموجود في الطرف الأميني (N-terminal) لأحد الببتيدين رابطة ثيوإستر الموجودة في الطرف الكربوكسيلي (C-terminal) لببتيد آخر [Dawson et al.,(1994) Science266, 776-779]. [Tam et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA92, 12485-12489]. في البداية، تتشكل رابطة ثيوإستر جديدة من خلال عملية تبادل الثيوإستر، والتي تتضمن هجوم مجموعة السلفهيدريل لبقايا السيستين الطرفية N على رابطة الثيوإستر الطرفية C. ثم يخضع ناتج الربط المؤقت لإعادة ترتيب تلقائي من نوع SN أسيل، ليتحول من رابطة ثيوإستر إلى رابطة ببتيدية مستقرة. وقد وُصفت هذه التقنية أيضًا باسم "ربط البروتين المُعبَّر عنه" [Muir et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA95,6705-6710; Severinov and Muir (1998) J. Biol. Chem.273, 16205-16209]. س: ما هي استخدامات تقنية IPL؟ ج: نظرًا لأن تقنية IPL تسمح بدمج الببتيدات الاصطناعية، بالإضافة إلى البروتينات المُعبر عنها بكتيريًا، مع بروتين مُعبر عنه في نظام IMPACT، فقد استُخدمت هذه التقنية في مجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك: التعبير عن البروتينات السامة للخلايا [Evans et al., (1998) Protein Sci.7: 2256-2264]. ووسم البروتينات بمركبات مشعة، وكذلك بببتيدات اصطناعية تحتوي على البيوتين أو الفلورسين [Chong et al., (1997) Gene 192: 277-281; ​​Evans et al., (1998) Protein Sci.7: 2256-2264, Muir et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710]. ودراسة تفاعلات البروتين-بروتين [Severinov et al., (1998) J. Biol. Chem. [273:16205-16209] توليد ركائز الكيناز عن طريق تغيير موقع تعرف الكيناز على مستوى البروتين بدلاً من مستوى الحمض النووي [Ghosh, I. et al., (2004 J. of Imm. Methods. 293:85-95; Xu, J. et al., (2004) Biotechniques. 36: 976 -981.] توليد ركائز الفوسفاتاز [Kochinyan, S. et. al. (2007) Use of intein-mediated phosphoprotein arrays to study substrate specificity of protein phosphatases. Biotechniques 42(1): 63-9] الوسم النظائري للبروتينات لتحليل الرنين المغناطيسي النووي [Xu et al., (1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,388-393] توليد الركائز لتحليل مصفوفات البروتين [Sun, L., et al., (2004) Biotechniques. 37:430-443]. دمج جزيئات دهنية في البروتين بشكل محدد الموقع [Rak et al., (2003) Science 302, 646-650]. لمزيد من المعلومات، يُرجى الرجوع إلى الأسئلة الشائعة المفصلة حول IMPACT. س: أين يمكنني العثور على جميع الأسئلة الشائعة حول IMPACT؟ ج: الأسئلة الشائعة حول IMPACT. س: ما هو عمود الفصل بالجاذبية الذي توصون به؟ ​​ج: نوصي باستخدام عمود Econo Column من Bio-Rad بقطر داخلي 2.5 سم أو عمود Kontes Flex-Column. يمكن تكبير أو تصغير أحجام الأعمدة (القطر الداخلي والطول) ويجب أن تستند إلى كمية الراتنج اللازمة لعزل البروتين المطلوب بكميات كافية. س: ما هي بادئات التسلسل التي توصون بها لناقلات pTXB1 وpTYB21؟ ج: لتسلسل جين مستنسخ في الطرف الكربوكسيلي بالنسبة لناقل الاندماج pTXB1، نوصي باستخدام البادئ العالمي T7 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3') المكمل لمُحفِّز T7، والذي يُنتج تسلسلًا في اتجاه النسخ. يُمكن استخدام هذا البادئ، بالإضافة إلى البادئ العكسي Mxe Intein II (5'-GAT TGC CAT GCC GGT CAA GG-3') أو البادئ العكسي Mxe Intein (5'-GGC ACG ATG TCG GCG ATG-3')، لتحديد تسلسل القطعة المُدرجة. يرتبط البادئ العكسي Mxe Intein II بحوالي 110 زوجًا قاعديًا من الطرف 5' لجين Mxe intein. ويرتبط البادئ العكسي Mxe Intein بحوالي 50 زوجًا قاعديًا في اتجاه المصب من الطرف 5' للجين.