وحدة تحويل الميثيل الإنزيمية NEBNext® من شركة نيو إنجلاند بيولابس، طراز E7125L

الفئات ذات الصلة بـ NEBNext: التحويل الأنزيمي لتحليل مثيلة الحمض النووي، والأتمتة لتحضير مكتبة NEBNext® NGS، وتحليل مثيلة الحمض النووي، والمواد المطلوبة (غير المرفقة): أنابيب شرائح PCR، فورماميد (سيجما #F9037-100 مل) أو هيدروكسيد الصوديوم 0.1 N، إيثانول 80%، محلول TE 0.1X، درجة الحموضة 8.0، ماء خالٍ من النيوكلياز، خرز تنقية العينات: خرز تنقية عينات NEBNext (مرفق مع مجموعة Enzymatic Methyl-seq، NEB #E7120)، أو مجموعة كواشف SPRIselect® (بيكمان كولتر، Inc. #B23317)، أو خرز AMPure® XP (بيكمان كولتر، Inc. #A63881) أو من الشركة المصنعة المفضلة للخرز. حامل/قاعدة مغناطيسية، مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext (NEB #S1515)، جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل Bioanalyzer®، TapeStation® والمواد الاستهلاكية المرتبطة به، أو أي محلل شظايا آخر. الأسئلة الشائعة : س: ما أنواع العينات التي يمكن معالجتها باستخدام مجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq ووحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq؟ ج: يمكن استخدام NEBNext Enzymatic Methyl-seq مع الحمض النووي الجينومي، والحمض النووي الخالي من الخلايا، والحمض النووي المُثبت بالفورمالين والمُضمن في البارافين (FFPE). س: ما المدخلات الموصى بها لمجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq ووحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq؟ ج: تم تحسين البروتوكول للمدخلات التي تتراوح بين 10 و200 نانوغرام. كما يتوفر بروتوكول مُعدل للمدخلات التي تصل إلى 500 نانوغرام. س: ما الفرق بين مجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq ووحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq؟ ج: تحتوي مجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq على جميع المكونات اللازمة لإنشاء مكتبة EM-seq، بما في ذلك الكواشف اللازمة لأكسدة 5-mC/5-hmC وإزالة أمين السيتوزين، وكواشف بناء المكتبة، ومحول EM-seq، بالإضافة إلى مزيج NEBNext Q5U الرئيسي وبادئين فريدين لتضخيم المكتبة. لا تحتوي وحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq على كواشف لبناء المكتبة وتضخيمها، أو محولات وبادئات. س: ما هي المحاليل المنظمة الموصى بها لتقطيع الحمض النووي في سير عمل NEB's enzymatic methyl-seq (EM-seq™)؟ ج: لاستخدام مجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq Kit (NEB #E7120)، يجب تقطيع الحمض النووي في أحد المحاليل المنظمة التالية: 10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 7.5 أو 8.0، أو 1X TE (10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0، 1 ملي مولار EDTA)، أو محلول TE منخفض التركيز (10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0، 0.1 ملي مولار EDTA). لا نوصي بتقطيع الحمض النووي المدخل في محلول TE بتركيز 0.1X (1 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA) أو الماء. لاستخدام وحدة تحويل NEBNext® Enzymatic Methyl-seq Conversion Module (NEB #E7125)، يجب ألا يكون الحمض النووي في محلول منظم يحتوي على EDTA قبل البدء بتفاعل الأكسدة. لذا، يُوصى بتقطيع الحمض النووي في محلول Tris بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 8.0. بدلاً من ذلك، في حال التقطيع في محلول TE بتركيز 1X أو تركيز منخفض من TE، يلزم تنظيف العمود أو الخرز، ثم الإذابة في محلول Tris-HCl بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 8.0 أو ماء خالٍ من النيوكلياز. س: هل يمكن تخزين محلول TET2 النشط لأكثر من 4 أشهر؟ ج: لا. يجب التخلص من محلول TET2 النشط بعد 4 أشهر. س: هل يمكن تخزين محلول الحديد الثنائي المخفف حديثًا لفترة طويلة؟ ج: لا. يجب التخلص من محلول الحديد المخفف حديثًا فور استخدامه. س: لماذا تختلف خرزات تنقية العينات NEBNext في بعض مراحل بروتوكول EM-seq عند تنظيف العينة؟ ج: يتغير سلوك الخرزات تبعًا لعملية التنظيف وخطوة تفاعل EM-seq السابقة. يجب توخي الحذر بعد إزالة الأمين بواسطة إنزيم APOBEC لأن الخرز يميل إلى التكتل بسهولة أكبر. تجنب تجفيف الخرز بشكل مفرط قبل استخلاص الحمض النووي في هذه الخطوة، فقد يؤدي ذلك إلى صعوبة إعادة تعليق الخرز، وربما انخفاض كمية الحمض النووي المستخلص منه. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي المُجزأ إنزيميًا كمادة إدخال لتقنية EM-seq™؟ ج: إن NEBNext UltraShear™ هو كاشف التجزئة الإنزيمي الوحيد الذي نوصي به قبل بدء عملية EM-Seq. لا نوصي باستخدام طرق التجزئة الأخرى القائمة على الإنزيمات لأنها قد تؤثر على علامات مثيلة الحمض النووي. لاستخدام NEBNext UltraShear™ مع تقنية EM-seq™، يُرجى اتباع البروتوكول الوارد في "القسم 3" في الدليل المرفق أدناه. https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manualm7634.pdf?rev=64e0e81d781748dba43702e4a78da971&hash=09F5E6499849C9045DFAE1A3AB3BDAA9 س: هل يمكنني استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بدلاً من الفورماميد لفصل سلسلتي الحمض النووي (DNA) قبل تفاعل إزالة الأمين؟ ج: نعم، من الممكن استخدام هيدروكسيد الصوديوم، على الرغم من أن الفورماميد يُوصى به لسهولة التعامل معه. عند استخدام هيدروكسيد الصوديوم، من الضروري أن يكون تركيز محلول هيدروكسيد الصوديوم دقيقًا وأن يكون الحجم المُضاف إلى التفاعل 4 ميكرولتر بالضبط. هيدروكسيد الصوديوم مادة شديدة التآكل. يجب اتباع إرشادات السلامة المحلية والمؤسسية عند التعامل مع هيدروكسيد الصوديوم. إذا كنت تُحضّر محلولًا مُخففًا من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 2 مولار، فتأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي لا يقل عن 12.5. تحقق من درجة حموضة المحلول الأصلي قبل الاستخدام. تجنب التخفيفات غير الدقيقة بتحضير حجم كافٍ من هيدروكسيد الصوديوم المخفف لتقليل أخطاء السحب بالماصة. نوصي بتحضير 1 مل على الأقل. حضّر محاليل هيدروكسيد الصوديوم المخففة طازجة أو خزّن أجزاءً مخففة في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر لتجنب تغير التركيز. هيدروكسيد الصوديوم الصلب مادة متميعة (تمتص الرطوبة من الجو). لا يمكن وزنه بدقة. لذلك، يجب معايرة المحاليل المحضرة من حبيبات هيدروكسيد الصوديوم للوصول إلى التركيز المناسب. س: هل من الطبيعي أن يكون محلول الحديد الثنائي الناتج عن تسلسل EM أصفر اللون أو أن يُلاحظ تغير في اللون؟ ج: نعم، لوحظ تغير في اللون (من عديم اللون إلى أصفر). أظهرت الاختبارات عدم وجود فرق في الأداء بناءً على هذا التغير. س: هل يمكنني استخدام هيدروكسيد الصوديوم بدلاً من الفورماميد لفصل سلسلتي الحمض النووي قبل تفاعل إزالة الأمين؟ س: هل يمكنني استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بدلاً من الفورماميد لفصل سلسلتي الحمض النووي قبل تفاعل إزالة الأمين؟ نعم، من الممكن استخدام هيدروكسيد الصوديوم، مع أن الفورماميد مُوصى به لسهولة استخدامه. عند استخدام هيدروكسيد الصوديوم، يجب أن يكون تركيز محلوله دقيقًا، وأن يكون حجمه المُضاف إلى التفاعل 4 ميكرولتر بالضبط. هيدروكسيد الصوديوم مادة شديدة التآكل، لذا يجب اتباع إرشادات السلامة المحلية والمؤسسية عند التعامل معه. إذا كنت تُحضّر محلولًا مُخففًا من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 2 مولار، فتأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي لا يقل عن 12.5. تحقق من الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي قبل الاستخدام. تجنب التخفيفات غير الدقيقة بتحضير حجم كافٍ من هيدروكسيد الصوديوم المُخفف لتقليل أخطاء السحب بالماصة. نوصي بتحضير 1 مل على الأقل. حضّر محاليل هيدروكسيد الصوديوم المُخففة طازجة أو خزّن أجزاءً مُخففة في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر لتجنب تغير التركيز. هيدروكسيد الصوديوم الصلب مادة مُتميعة (تمتص الرطوبة من الجو). لا يمكن وزنه بدقة. لذلك، يجب معايرة المحاليل المُحضّرة من حبيبات هيدروكسيد الصوديوم للوصول إلى التركيز المناسب. س: هل من الطبيعي أن يكون محلول الحديد الثنائي من منتج EM-seq™ أصفر اللون أو أن يُلاحظ تغير في اللون؟ ج: نعم، لوحظ تغير في اللون (من عديم اللون إلى أصفر). وقد أظهرت الاختبارات عدم وجود فرق في الأداء بناءً على هذا التغير.