نيو إنجلاند بيولابس، E7360L، وحدة إصلاح الحمض النووي FFPE الإصدار الثاني من NEBNext

يعمل هذا المنتج الجديد على تحسين إصلاح الحمض النووي FFPE في سير عمل التسلسل من الجيل التالي (NGS). الفئات ذات الصلة: الحمض النووي المُثبت بالفورمالين والمُضمن في البارافين (FFPE)، مواصفات تحضير مكتبة تسلسل الجيل التالي . المواد المطلوبة (غير مُرفقة) : مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext Ultra II (NEB #E7645S، #E7645L، #E7103S أو #E7103L) لـ Illumina، أو غيرها. 80% إيثانول، ماء خالٍ من النيوكلياز، 0.1X TE (1 مليمولار Tris-HCl، درجة الحموضة 8.0، 0.1 مليمولار EDTA)، أنابيب شرائح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) خالية من DNase وRNase، أنابيب DNA LoBind® (Eppendorf #022431021)، مجموعة كواشف SPRIselect® (Beckman Coulter, Inc. #B23317) أو خرز AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881)، NEBNext Multiplex Oligos لـ Illumina (www.neb.com/oligos)، مغناطيسي حامل/رف (NEB #S1515، Alpaqua® cat. #A001322، أو ما يعادلهما) جهاز التدوير الحراري Agilent Bioanalyzer® أو TapeStation® والكواشف والمواد الاستهلاكية المرتبطة به. محلول تخفيف المحول NEB #B1430S أو محلول تخفيف محول NEBNext Unique Dual Index UMI المرفق مع NEB #E7395S/L. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين وحدة إصلاح الحمض النووي NEBNext FFPE DNA v2 (NEB #E7360) ومزيج إصلاح الحمض النووي NEBNext FFPE (NEB #M6630)؟ ج: تحتوي وحدة إصلاح الحمض النووي NEBNext FFPE v2 على نفس أنشطة الإصلاح الموجودة في مزيج إصلاح الحمض النووي NEBNext FFPE، ولكنها مُحسَّنة لزيادة كفاءة الإصلاح، وتبسيط سير العمل مع تحضير مكتبة NEBNext، ومحلول تفاعل أكثر ملاءمة يحتوي على جميع مكونات المحلول المطلوبة ليس فقط لإصلاح الحمض النووي بكفاءة، ولكن أيضًا لإصلاح النهايات اللاحقة وإضافة ذيل dA. س: هل ستربط وحدة إصلاح الحمض النووي FFPE DNA Repair v2 شظايا الحمض النووي الخاصة بي؟ ج: يعمل الليغاز الموجود في وحدة إصلاح الحمض النووي FFPE DNA Repair v2 على سد الشقوق في الحمض النووي بشكل فعال، ولكنه غير فعال في ربط الشظايا عند عدم التطابق أو في ربط الحمض النووي ذي النهايات غير المتداخلة. لم نلاحظ أن هذا الليغاز يربط الحمض النووي ذي النهايات غير المتداخلة. س: هل ستؤثر معالجة الحمض النووي الخاص بي بوحدة إصلاح الحمض النووي FFPE DNA Repair v2 سلبًا على التفاعل اللاحق؟ ج: لم نلاحظ أن وحدة إصلاح الحمض النووي FFPE DNA Repair v2 لها تأثير سلبي على معظم التطبيقات اللاحقة. سيعمل مزيج الإصلاح فقط على القواعد التالفة والشقوق والفجوات. ومع ذلك، في التطبيقات المتخصصة، مثل الكشف عن المثيلة في العينات التالفة، هناك احتمال أن تؤدي رقعة القواعد التي تم ملؤها أثناء وظيفة ترجمة الشقوق في الإصلاح إلى محو بصمات المثيلة. يكون هذا التأثير أكثر وضوحًا في التجارب التي تحتوي على كميات قليلة من الحمض النووي. س: هل ستؤدي وحدة إصلاح الحمض النووي FFPE DNA Repair v2 إلى جعل نهايات الحمض النووي غير متداخلة؟ س: هل تقوم وحدة إصلاح الحمض النووي FFPE v2 من NEBNext بملء النهايات المتدلية 5′، ولكنها لا تزيل النهايات المتدلية 3′؟ ج: لا، يقوم إنزيم البوليميراز الموجود في وحدة إصلاح الحمض النووي FFPE v2 بملء النهايات المتدلية 5′، ولكنه لا يزيل النهايات المتدلية 3′. علاوة على ذلك، قد يضيف هذا الإنزيم نيوكليوتيد أدينين (dA) إلى النهاية المتدلية 5′ المملوءة. س: هل تقوم وحدة إصلاح الحمض النووي FFPE v2 بإدخال نيوكليوتيدات عشوائية في التسلسل الذي تقوم بإصلاحه؟ ج: لا، يقوم إنزيم البوليميراز الموجود في المزيج بإضافة القواعد المكملة التي تتوافق مع السلسلة الأصلية. ولن يُدخل مزيج الإصلاح أي شوائب في التسلسل. س: هل تقوم وحدة إصلاح الحمض النووي FFPE v2 بإزالة التعديلات التساهمية من قواعد الحمض النووي، مثل البيوتين أو الديجوكسيجينين؟ ج: لا، لن يزيل مزيج الإصلاح هذا التعديلات التساهمية في قواعد الحمض النووي. س: هل يقوم مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE v2 بإصلاح الروابط المتشابكة بين الحمض النووي والبروتين؟ ج: لا، لا يقوم مزيج الإصلاح بإصلاح الروابط المتشابكة بين الحمض النووي والبروتين. س: هل يقوم مزيج إصلاح الحمض النووي FFPE v2 بإصلاح النهايات 3′ المسدودة؟ ج: نعم، سيعمل مزيج الإصلاح على تلميع الطرف 3′ ليصبح مجموعة هيدروكسيل إذا كان هناك انسداد في هذا الطرف. س: هل يستطيع مزيج FFPE DNA Repair v2 إصلاح التلف في كل من الحمض النووي أحادي وثنائي السلسلة؟ أم أنه يتطلب حمضًا نوويًا ثنائي السلسلة كقالب؟ ج: يتطلب نشاط الإصلاح الكامل لمزيج FFPE DNA Repair v2 وجود حمض نووي ثنائي السلسلة لعملية البلمرة والربط. مع ذلك، سيتم استئصال القواعد التالفة، مثل dU الموجودة في الحمض النووي أحادي السلسلة، أثناء عملية الإصلاح ولن تُدمج في مكتبة التسلسل. س: إذا كان لدي قالب حمض نووي يحتوي على مواقع طفرات (مثل 8-أوكسي غوانين أو سيتوزين منزوع الأمين) متجاورة مباشرة على سلسلتين متقابلتين، فهل سيؤدي العلاج بمزيج FFPE DNA Repair v2 إلى حدوث قطع/كسر في السلسلتين؟ ج: لم نختبر إصلاح مواقع الطفرات المتجاورة على السلسلتين المتقابلتين. في هذه الحالة، إذا أُزيلت القاعدتان التالفتان في الوقت نفسه، فقد يحدث كسر في سلسلتي الحمض النووي، مما يؤدي إلى تفتت الحمض النووي. أما إذا كان أحد التفاعلين أسرع من الآخر، ولم يحدثا في الوقت نفسه، فإن مزيج FFPE DNA Repair v2 سيقوم بإصلاحهما. س: ما هي أطوال الفجوات التي يمكن إصلاحها باستخدام مزيج FFPE DNA Repair v2؟ ج: طول الفجوة غير معروف بدقة. بناءً على خبرتنا، يتراوح بين 5 و10 نيوكليوتيدات. س: هل يمكن لوحدة FFPE DNA Repair v2 إصلاح الحمض النووي المعالج بالبيسلفيت؟ ج: ينتج عن معالجة الحمض النووي بالبيسلفيت حمض نووي أحادي السلسلة يحتوي على اليوراسيل، والذي لا يمكن إصلاحه بالكامل بواسطة أنشطة البلمرة والربط لهذا المزيج. سيتم استئصال قواعد dU الموجودة في الحمض النووي أحادي السلسلة، ولكن لن يتم إصلاحها بالكامل. س: عند العمل مع الحمض النووي المتفتت، هل ستقوم وحدة FFPE DNA Repair v2 بربط الأطراف معًا؟ ج: لا، إنزيم الليغاز الموجود في المزيج سيربط فقط عند وجود قطع في الحمض النووي المزدوج. س: كيف يتم إصلاح المواقع الخالية من القواعد بواسطة وحدة إصلاح الحمض النووي FFPE الإصدار الثاني؟ ج: بالنسبة للحمض النووي المزدوج، يتعرف مزيج الإصلاح على الموقع الخالي من القواعد ويقطع هيكل الحمض النووي. يستبدل إنزيم البوليميراز القاعدة المفقودة بالقاعدة الصحيحة، ثم يقوم إنزيم الليغاز بربط الحمض النووي. س: هل يمكنني استخدام وحدة إصلاح الحمض النووي FFPE الإصدار الثاني لإصلاح أنواع أخرى من الحمض النووي منخفض الجودة غير الحمض النووي FFPE؟ ج: نعم. سيصلح مزيج الإصلاح أنواعًا عديدة من تلف الحمض النووي الشائعة في أنواع أخرى من الحمض النووي منخفض الجودة، مثل التلف الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية أو التلف التأكسدي.