نيو إنجلاند بيولابس، E7400X، مجموعة استنفاد الحمض النووي الريبوزي NEBNext® الإصدار 2 (بشري/فأر/جرذ)

إن وفرة الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA)، الذي يشكل 80-90% من إجمالي الحمض النووي الريبوزي، تستلزم إزالته قبل تقنيات التسلسل الجيني من الجيل التالي وغيرها من التطبيقات. تتضمن هذه المجموعة من الجيل الثاني لإزالة الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي تحسينات في الكواشف والمجسات والبروتوكول، مما ينتج عنه أداء إزالة فائق. يتيح سير العمل الفعال القائم على إنزيم RNAse-H، والتقارب الشديد بين المجسات، إزالة فعالة من الحمض النووي الريبوزي ذي الجودة المنخفضة والعالية على حد سواء، مع نطاق واسع من كميات الإدخال. الفئات ذات الصلة: استنزاف الحمض النووي الريبوزي (RNA) وإثراء الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، تحليل الإبيترانسكريبتوم، تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) لمواصفات Illumina. المواد المطلوبة (غير المرفقة ): ماصات، حامل مغناطيسي (NEB #S1515)، صفيحة مغناطيسية (Alpaqua، رقم المنتج A001322) أو ما يعادلها، إيثانول 80% (مُحضر حديثًا)، أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) رقيقة الجدران سعة 200 ميكرولتر وأنابيب سعة 1.5 مل، جهاز طرد مركزي دقيق، خلاط دوامي، جهاز تدوير حراري، جهاز Bioanalyzer، TapeStation (Agilent Technologies, Inc.) أو جهاز ومواد استهلاكية مماثلة، Agencourt، RNAClean، خرز XP (Beckman Coulter, Inc. #A63987). الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين مجموعة استنزاف الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) NEBNext® الإصدار الثاني (بشري/فأري/جرذي) ومجموعة استنزاف الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) الأصلية NEBNext® (بشري/فأري/جرذي)؟ ج: تتميز مجموعة NEBNext® rRNA Depletion Kit v2 بتصميم محسّن للمجسات يستهدف جميع الوحدات الفرعية للرنا الريبوسومي البشري الأولي (5S، 5.8S، 18S، 28S، ITS، ETS)، وتغطية أفضل للرنا الريبوسومي الناضج للفأر والجرذ، بالإضافة إلى تركيبات إنزيمية محسّنة. س: ما هي الأنواع المتوافقة مع مجموعة NEBNext® rRNA Depletion Kit v2 (الإنسان/الفأر/الجرذ)؟ هل ستعمل مع أنواع أخرى؟ ج: تعمل المجموعة على استنفاد الرنا الريبوسومي من الرنا الكلي للإنسان والفأر والجرذ. ويمكن استخدامها مع عينات من أنواع أخرى طالما كانت تسلسلات الرنا الريبوسومي متشابهة مع تسلسلات الإنسان والفأر والجرذ. س: ما هي الوحدات الفرعية للرنا الريبوسومي التي يتم استنفادها باستخدام مجموعة NEBNext® rRNA Depletion Kit v2 (الإنسان/الفأر/الجرذ)؟ ج: تعمل هذه المجموعة على استنفاد كل من الحمض النووي الريبوزي (rRNA) السيتوبلازمي (5S، 5.8S، 18S، و28S، وITS البشري، وETS) والميتوكوندري (12S و16S). س: هل يمكنني استخدام هذا المنتج مع الحمض النووي الريبوزي المتدهور أو المجزأ؟ ج: نعم، يمكن استخدام هذه المجموعة مع الحمض النووي الريبوزي المتدهور أو المجزأ. س: ما هي كمية الحمض النووي الريبوزي الكلية التي يجب استخدامها؟ ج: تم تحسين المجموعة لاستخدام 5-1000 نانوغرام من الحمض النووي الريبوزي الكلي عالي الجودة (RIN = 8-9) و10-1000 نانوغرام من الحمض النووي الريبوزي المتدهور أو المجزأ (RIN ≤ 2، مثل الحمض النووي الريبوزي المستخلص من الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين). س: لماذا يجب أن يكون الحمض النووي الريبوزي خاليًا من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA)؟ ج: يمكن أن يؤدي تلوث الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين إلى عدم دقة قياس كمية الحمض النووي الريبوزي وإعاقة الإزالة الصحيحة للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) للغلوبين. س: ما هو ناتج الحمض النووي الريبوزي المتوقع استعادته بعد استنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي؟ ج: تختلف نسبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) المعزول بعد استنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) باختلاف نوع الحمض النووي الريبوزي (مصادر مختلفة أو أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبوزي). عادةً، نلاحظ إزالة حوالي 98% من الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي. س: ما هي نسبة الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي المتبقية بعد الاستنفاد؟ ج: تختلف نسبة الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي المتبقية بعد الاستنفاد باختلاف الأنواع. عادةً، نلاحظ بقاء ما بين 1% (في الإنسان) و3% (في الفأر/الجرذ) من الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي. س: كيف يمكنني تحديد ما إذا كان استنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي فعالاً؟ ج: لتقييم كفاءة الاستنفاد، صمم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) للحمض النووي الريبوزي الريبوسومي الخاص بالنوع المدروس، وبادئات لجين مرجعي. قارن محتوى الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي قبل الاستنفاد وبعده. س: هل تعمل مجموعة NEBNext® لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي الإصدار 2 (للإنسان/الفأر/الجرذ) في تطبيقات بصمة الريبوسوم أو تحديد خصائصه؟ ج: لم يتم التحقق من صحة البروتوكول المرفق بهذه المجموعة لتحديد بصمة الريبوسوم أو تحليلها. س: هل يمكنني استخدام خرز Agencourt® AMPure® XP المغناطيسي بدلاً من خرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي NEBNext® (خرز RNAClean® XP المغناطيسي)؟ ج: نعم، من الممكن استخدام خرز AMPure XP. ومع ذلك، نوصي باستخدام خرز RNAClean XP / خرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي NEBNext® (المرفقة في NEB #E7860) حيث تم تصنيع هذه الخرز واختبارها للقضاء على تلوث RNase. يتضمن إصدار من المجموعة هذه الخرز: مجموعة NEBNext® لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي (للبكتيريا) مع خرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي (NEB #E7860). س: هل يمكنني استخدام طرق تنقية أخرى غير خرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي NEBNext® / خرز Agencourt® RNAClean® XP المغناطيسي؟ ج: على الرغم من أننا نوصي باستخدام خرز RNAClean® XP لتنقية عينات الحمض النووي الريبوزي (المرفقة في عبوة NEB رقم E7755)، إلا أنه يمكن تنقية العينات المستنفدة من الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) عن طريق الترسيب بالإيثانول أو باستخدام أدوات تنقية أعمدة الحمض النووي الريبوزي مثل مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (NEB رقم T2030). للاستخدام مع أعمدة أخرى، يُرجى مراجعة مواصفات العمود لمعرفة نطاق حجم الحمض النووي الريبوزي لضمان الاحتفاظ بأي حمض نووي ريبوزي مجزأ أثناء عملية التنقية. س: لإزالة الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي من الحمض النووي الريبوزي الكلي، هل يجب استخدام وحدة العزل المغناطيسي NEBNext Poly(A) mRNA (NEB رقم E7490) أم مجموعة NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (للبشر، والفأر، والجرذ)؟ ج: تعمل مجموعات NEBNext rRNA Depletion Kits على إثراء النسخ متعددة الأدينين بالإضافة إلى الحمض النووي الريبوزي غير متعدد الأدينين (مثل الحمض النووي الريبوزي غير المشفر والنسخ المضادة). تحتفظ وحدة العزل المغناطيسي NEBNext Poly(A) mRNA فقط بالنسخ متعددة الأدينين. يمكن استخدام مجموعات استنفاد rRNA من NEBNext مع عينات RNA الكلية منخفضة الجودة. تتطلب وحدة العزل المغناطيسي NEBNext Poly(A) mRNA RNA الكلية عالية الجودة. س: هل يمكنني استخدام أكثر من نوع واحد من محلول استنفاد NEBNext في عملية استنفاد RNA من NEBNext؟ ج: نعم، من الممكن دمج المجسات. يمكن استخدام أي مزيج من محاليل استنزاف NEBNext (مجموعة استنزاف الحمض النووي الريبوزي NEBNext (بشري/فأري/جرذي) (NEB #E7400/E7405)؛ مجموعة استنزاف الحمض النووي الريبوزي NEBNext (بكتيريا) (NEB# E7850/E7860)؛ مجموعة استنزاف الغلوبين والحمض النووي الريبوزي NEBNext (بشري/فأري/جرذي) (NEB #E7750/E7755)) في خطوة تهجين المجسات. يجب أن يظل حجم العينة الكلي ثابتًا (15 ميكرولتر) خلال خطوة تهجين المجسات. كما يجب أن يظل حجم محلول تهجين المجسات ثابتًا (2 ميكرولتر). ينبغي تحديد حجم كل محلول استنزاف على حدة تجريبيًا من خلال تجربة معايرة الإدخال، حيث أن الكمية المثلى للمجسات تختلف باختلاف نوع العينة. في حال عدم توفر هذه البيانات التجريبية، يمكن إضافة المجسات بنسبة 1:1. بما أن الحجم الكلي للتفاعل هو 15 ميكرولتر يعتمد حجم الحمض النووي الريبوزي الكلي الذي يمكن إضافته (ميكرولتر) على الحجم المتبقي بعد إضافة 2 ميكرولتر من محلول التهجين وحجم محاليل الاستنزاف. إذا كنت تخفف الحمض النووي الريبوزي الكلي في ماء خالٍ من النيوكلياز قبل الاستنزاف، فيمكن تقليل حجم الماء الخالي من النيوكلياز لاستيعاب حجم أكبر من محلول استنزاف NEBNext. حجم تفاعل تهجين الحمض النووي الريبوزي/المسبار: الحمض النووي الريبوزي الكلي في ماء خالٍ من النيوكلياز (10 نانوغرام - 1 ميكروغرام): متغير، حتى 11 ميكرولتر. مزيج محاليل الاستنزاف: متغير (أبيض). محلول تهجين مسبار NEBNext: 2 ميكرولتر. الحجم الكلي: 15 ميكرولتر. يرجى الرجوع إلى البروتوكول في دليل NEB #E7400 أو NEB #E7750 أو NEB #E7850. سؤال: هل يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي المُخصب الناتج عن مجموعة استنزاف NEBNext؟ في تطبيقات التسلسل طويل القراءة؟ ج: نعم، ولكن تجدر الإشارة إلى أن الحمض النووي الريبوزي (RNA) يتعرض للتجزئة إلى حد ما أثناء عملية الاستنزاف. وهذا قد يقلل من طول القراءة.