نيو إنجلاند بيولابس، E7410S، مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل NEBNext® Ultra™ II لـ Illumina®

توفر مجموعة NEBNext Ultra II DNA PCR-free Library Prep Kit for Illumina سير عمل خالياً من التضخيم لتسلسل الحمض النووي (DNA-seq) يعتمد على سير عمل Ultra II المبسط والموثوق. ابدأ بكمية قليلة تصل إلى 250 نانوغرام من الحمض النووي، واحصل على مكتبات عالية الجودة والإنتاجية التي تحتاجها دون أي تحيز ناتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الفئات ذات الصلة: التحقق من صحة تحرير الجينات بتقنية CRISPR، تحضير مكتبات الحمض النووي لـ Illumina، أتمتة تحضير مكتبات NEBNext® NGS، الأسئلة الشائعة : س: ما هو التطبيق الرئيسي لمجموعة NEBNext Ultra II DNA PCR-free Library Prep Kit؟ ج: تم تحسين مجموعة NEBNext Ultra II DNA PCR-free Library Prep Kit لتحضير مكتبات عالية الجودة وخالية من التضخيم لتسلسل الجينوم الكامل على منصات Illumina. س: ما هي الكواشف الإضافية التي أحتاجها لإكمال سير عمل Ultra II DNA PCR-free؟ ج: بالإضافة إلى مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل NEBNext Ultra II، ستحتاج إلى مجموعة NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Unique Dual Index Adaptors DNA Set 1) (NEB #E7395) لإكمال سير العمل. يُرجى العلم أن جميع أنواع الأوليغومرات الأخرى من NEB غير متوافقة مع سير العمل الخالي من تفاعل البوليميراز المتسلسل. س: هل يمكن استخدام العينات المتدهورة لتحضير مكتبات الحمض النووي الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل Ultra II؟ ج: لا، لا نوصي باستخدام العينات المتدهورة كمادة أولية لسير العمل الخالي من تفاعل البوليميراز المتسلسل. قد يؤدي استخدام الحمض النووي المتدهور ذي الجودة المنخفضة إلى انخفاض كبير في الإنتاجية وفقدان العينات أثناء خطوات التنظيف. س: ما نوع وكمية المادة الأولية التي أحتاجها عند تحضير المكتبات باستخدام مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل NEBNext Ultra II؟ ج: هذه المجموعة مناسبة لكمية تتراوح بين 250 نانوغرام و1 ميكروغرام من الحمض النووي عالي الجودة المجزأ. س: ما هي طرق التقطيع التي توصون بها لسير عمل NEBNext Ultra II DNA الخالي من تفاعل البوليميراز المتسلسل؟ ج: تم تحسين البروتوكول للتقطيع باستخدام تجزئة Covaris. للتجزئة الأنزيمية، استخدموا مجموعة تحضير مكتبة NEBNext® Ultra™ II FS DNA الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل لـ Illumina® (NEB #E7430). س: لأي نوع من تحضير العينات/بناء المكتبة يمكنني استخدام مجموعة تحضير مكتبة NEBNext Ultra II DNA الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل لـ Illumina؟ ج: تتوافق مجموعة تحضير مكتبة NEBNext Ultra II DNA الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل لـ Illumina مع البروتوكولات التي تتطلب وجود امتداد 3´ A على جزيئات المكتبة لتسهيل الربط بالمحولات التي تحتوي على امتداد 3´ T، مثل تحضير المكتبة للتسلسل على منصة Illumina. في الوقت الحالي، قمنا بالتحقق من صحة مجموعة تحضير مكتبة Ultra II DNA الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل على منصة Illumina فقط. س: ماذا أفعل إذا رأيت راسبًا في محلول تفاعل تحضير نهايات الحمض النووي Ultra II؟ ج: من الشائع رؤية راسب أبيض في محلول إصلاح نهايات الحمض النووي Ultra II. في هذه الحالة، اترك المزيج حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم الماصة عدة مرات لسحب المحلول وتفتيت الراسب، ثم قم برجّه سريعًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. س: بعد خطوات تحضير نهايات الحمض النووي في سير عمل NEBNext Ultra II DNA الخالي من تفاعل البوليميراز المتسلسل، هل يمكن حفظ التفاعلات عند 4 درجات مئوية؟ ج: لا. نوصي بالانتقال مباشرةً إلى خطوة ربط المحول بمجرد وصول درجة حرارة التفاعل إلى 4 درجات مئوية. قد يؤدي ترك الحمض النووي المُحضر عند 4 درجات مئوية إلى انخفاض إنتاجية المكتبة. س: تفاعل الربط لزج جدًا. ماذا سيحدث إذا لم يتم خلطه جيدًا؟ ج: إذا لم يتم خلط تفاعل الربط جيدًا، فقد ينتج عن ذلك انخفاض في إنتاجية المكتبة. لضمان المزج الجيد، يمكن سحب المحلول وإعادة وضعه بالماصة عشر مرات، أو رجه باستخدام جهاز الخلط الدوامي لمدة ثلاث ثوانٍ. س: هل يمكن حفظ التفاعلات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بعد خطوة ربط المحولات؟ ج: لا. نوصي بالانتقال فورًا إلى خطوات تنظيف الخرز بمجرد وصول درجة حرارة التفاعل إلى 4 درجات مئوية. س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext Ultra II DNA PCR-free Library Prep Kit لتحضير المكتبات للتسلسل على أجهزة تسلسل Ion Torrent؟ ج: لا، المحولات المطلوبة لتسلسل Ion Torrent لها نهايات غير لاصقة، وليست ذات نهايات 5'-T بارزة، وهي غير متوافقة مع سير عمل NEBNext Ultra II DNA PCR-free. س: كيف يمكنني تحديد كمية مكتباتي الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: لا يمكن استخدام سوى الطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) (مثل مجموعة NEBNext Library Quant Kit for Illumina (NEB # E7630)) لتحديد كمية المكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بدقة. ستُستخدم طرق أخرى لتحديد كمية القطع التي قد لا تحتوي على محولات في كلا الطرفين، وبالتالي لن تُنتج تجمعات أو تسلسلات. س: هل يُمكنني تقييم جودة المكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام جهاز BioAnalyzer و/أو TapeStation؟ ج: يجب توخي الحذر عند استخدام جهازي BioAnalyzer وTapeStation لتقييم جودة المكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل. يُمكن أن يُفيد جهازا BioAnalyzer وTapeStation في الكشف عما إذا كانت المكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل مُلوثة بمحولات متبقية أو ثنائيات محولات. مع ذلك، فإن تقدير الحجم وتحديد كمية المكتبة ليسا دقيقين على جهازي BioAnalyzer وTapeStation. تتداخل المنطقة الطويلة أحادية السلسلة للمحولات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل مع هجرة المكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل، مما يجعلها تبدو أكبر بكثير. بالإضافة إلى ذلك، لا يستطيع جهازا BioAnalyzer وTapeStation التمييز بين قطع الحمض النووي المُدخلة وقطع الحمض النووي التي تحتوي على محول واحد أو اثنين مربوطين، مما يجعلهما غير مناسبين لتحديد الكمية. نوصي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لتحديد كمية المكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل. س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع محولات من موردين آخرين غير NEB؟ ج: نعم، من الممكن استخدام محولات من موردين آخرين غير NEB مع مجموعة تحضير مكتبة NEBNext الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يجب أن تكون المحولات من نوع T-overhang وأن تحتوي على جميع التسلسلات اللازمة للتسلسل على منصات Illumina. س: هل هذه الكواشف متوفرة بتنسيق مخصص، أو بتنسيق أكبر، أو بتنسيق 96 بئرًا؟ ج: نعم، يمكننا توفير تنسيقات مخصصة. يرجى التواصل مع قسم تصنيع المعدات الأصلية (OEM) لدينا على custom@neb.com لمزيد من التفاصيل. س: هل تتضمن المجموعة الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) محولات وبادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع محولات NEBNext Unique Dual Index UMI الخاصة بـ Illumina. للاطلاع على قائمة كاملة بالأوليغومرات المتوافقة، راجع العمود الأيمن من مخطط اختيار أوليغومرات NEBNext® Multiplex. تحتوي أدلة محولات NEBNext Unique Dual Index UMI أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات الربط. للاستخدام مع مجموعات تحضير المكتبات NEBNext، يُرجى الرجوع إلى دليل مجموعة تحضير المكتبات. للاطلاع على خيارات موازنة الألوان، يُرجى مراجعة مُحدد رموز NEBNext® Index Oligo Selector للاطلاع على تركيبات الرموز الشريطية الصالحة.