نيو إنجلاند بيولابس، E7430L، مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل NEBNext® Ultra™ II FS لتقنية Illumina®

توفر مجموعة NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free Library Prep Kit for Illumina سير عمل خالياً من التضخيم لتسلسل الحمض النووي (DNA-seq) يعتمد على سير عمل Ultra II FS المبسط والموثوق. ابدأ بكمية صغيرة من الحمض النووي (50 نانوغرام فقط)، واحصل على مكتبات عالية الجودة والإنتاجية دون أي تحيز ناتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الفئات ذات الصلة: التحقق من صحة تحرير الجينات بتقنية CRISPR، تحضير مكتبات الحمض النووي لـ Illumina، أتمتة تحضير مكتبات NEBNext® NGS، الأسئلة الشائعة : س: ما هو التطبيق الرئيسي لمجموعة NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free Library Prep Kit؟ ج: تم تحسين مجموعة NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free Library Prep Kit لتحضير مكتبات عالية الجودة وخالية من التضخيم لتسلسل الجينوم الكامل على منصات Illumina. س: ما هي الكواشف الإضافية التي أحتاجها لإكمال سير عمل Ultra II FS DNA PCR-free؟ ج: بالإضافة إلى مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل NEBNext Ultra II FS DNA، ستحتاج إلى مجموعة NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Unique Dual Index UMI Adaptors DNA Set 1) (NEB #E7395) لإكمال سير العمل. يُرجى العلم أن جميع أنواع الأوليغومرات الأخرى من NEB غير متوافقة مع سير العمل الخالي من تفاعل البوليميراز المتسلسل. س: لماذا يُضاف DTT إلى مجموعة Ultra II FS DNA الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل؟ ج: تُساعد إضافة DTT في خطوة التجزئة/تحضير الأطراف على تحقيق أحجام الإدخال الطويلة المطلوبة للمكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل. س: هل يُمكن استخدام العينات المتدهورة لتحضير مكتبات الحمض النووي الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل Ultra II FS DNA؟ ج: لا، لا نوصي باستخدام العينات المتدهورة كمادة إدخال لسير العمل الخالي من تفاعل البوليميراز المتسلسل. قد يؤدي استخدام الحمض النووي المتدهور أو منخفض الجودة إلى انخفاض كبير في الإنتاجية وفقدان العينات أثناء خطوات التنظيف. س: ما نوع وكمية المادة الأولية التي أحتاجها عند تحضير المكتبات باستخدام مجموعة NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free Library Prep Kit؟ ج: هذه المجموعة مناسبة لـ 100 نانوغرام إلى 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي السليم عالي الجودة باستخدام البروتوكول القياسي. بالإضافة إلى ذلك، نوفر بروتوكولًا بكمية قليلة (50-99 نانوغرام) لدعم المستخدمين الذين لا يستطيعون الحصول على عينة كافية للبروتوكول القياسي. س: عند تحضير العينات باستخدام مجموعة NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free Library Prep Kit، هل يمكن أن يكون الحمض النووي المدخل في محلول يحتوي على EDTA؟ ج: نعم، نوصي بأن يكون الحمض النووي في محلول TE بتركيز 1X أو محلول TE منخفض التركيز يحتوي على EDTA. يمكن أيضًا أن يكون الحمض النووي في محلول Tris بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 7.0-8.0 أو في الماء. س: ماذا أفعل إذا رأيت راسبًا في محلول التفاعل Ultra II FS؟ ج: من الشائع ملاحظة ترسبات في محلول تفاعل Ultra II FS. في حال حدوث ذلك، استخدم الماصة عدة مرات لخلط المحلول وتفتيت الراسب، ثم قم برجّه سريعًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. قد تلاحظ وجود كمية صغيرة من الترسبات، لكن هذا لن يؤثر على الأداء. س: هل من الضروري حقًا رجّ مزيج إنزيم Ultra II FS؟ ج: نعم، قد يؤدي عدم رجّ مزيج إنزيم Ultra II FS إلى نتائج متفاوتة. س: بعد خطوتي التجزئة وتحضير الأطراف في سير عمل NEBNext Ultra II FS الخالي من تفاعل البوليميراز المتسلسل، هل يمكن حفظ التفاعلات عند 4 درجات مئوية؟ ج: لا. نوصي بالانتقال مباشرةً إلى خطوة ربط المحولات بمجرد وصول درجة حرارة التفاعل إلى 4 درجات مئوية. قد يؤدي ترك الحمض النووي المُحضّر عند 4 درجات مئوية إلى انخفاض إنتاجية المكتبة. س: تفاعل الربط لزج جدًا. ماذا سيحدث إذا لم يتم خلطه جيدًا؟ ج: إذا لم يتم خلط تفاعل الربط جيدًا، فقد ينتج عنه كمية قليلة من المكتبة. لضمان الخلط الجيد، يمكن سحب المحلول وإعادة وضعه باستخدام الماصة 10 مرات، أو رجه باستخدام جهاز الخلط الدوامي لمدة 3 ثوانٍ. س: بعد خطوة ربط المحول، هل يمكن حفظ التفاعلات عند 4 درجات مئوية؟ ج: لا. نوصي بالانتقال فورًا إلى خطوات تنظيف الخرز بمجرد وصول درجة حرارة التفاعل إلى 4 درجات مئوية. س: هل يمكنني استخدام مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل NEBNext Ultra II FS لتحويل البيسلفيت أو سير عمل EM-seq™؟ ج: لا، مجموعة Ultra II FS DNA الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل غير متوافقة مع تحويل البيسلفيت أو سير عمل EM-seq. نوصي باستخدام القص الميكانيكي ومجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext Ultra II (NEB #E7645) لهذا التطبيق. س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free Library Prep Kit لتحضير مكتبات التسلسل على أجهزة Ion Torrent؟ ج: لا، لأن المحولات المطلوبة لتسلسل Ion Torrent ذات نهايات غير لاصقة، وليست ذات نهايات بارزة 3'-T، وهي غير متوافقة مع سير عمل Ultra II FS DNA PCR-free. س: كيف يمكنني تحديد كمية مكتباتي الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟ ج: لا يمكن استخدام سوى الطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) (مثل مجموعة NEBNext Library Quant Kit for Illumina (NEB # E7630)) لتحديد كمية المكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل بدقة. أما الطرق الأخرى، فستحدد كمية أجزاء قد لا تحتوي على محولات في كلا الطرفين، وبالتالي لن تُنتج تجمعات أو تسلسلات. س: هل يمكنني تقييم جودة المكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل على جهاز BioAnalyzer و/أو TapeStation؟ ج: يجب توخي الحذر عند استخدام جهازي BioAnalyzer وTapeStation لتقييم جودة المكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن أن يكون جهازا Bioanalyzer وTapeStation مفيدين في الكشف عما إذا كانت المكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ملوثة ببقايا المحولات أو ثنائيات المحولات. مع ذلك، فإن تقدير الحجم وتحديد كمية المكتبة ليسا دقيقين على جهازي Bioanalyzer وTapeStation. تتداخل المنطقة الطويلة أحادية السلسلة للمحولات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل مع هجرة المكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل، مما يجعلها تبدو أكبر بكثير. إضافةً إلى ذلك، لا يستطيع جهازا Bioanalyzer وTapeStation التمييز بين شظايا الحمض النووي المدخلة وشظايا الحمض النووي المرتبطة بمحول واحد أو اثنين، مما يجعلهما غير مناسبين للقياس الكمي. نوصي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لتحديد كمية المكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل. س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل مع محولات من موردين آخرين غير NEB؟ ج: نعم، من الممكن استخدام محولات من موردين آخرين غير NEB مع مجموعة تحضير المكتبات NEBNext الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجب أن تكون المحولات من نوع T-overhang وأن تحتوي على جميع التسلسلات اللازمة للتسلسل على منصات Illumina. س: هل تتضمن المجموعة الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) محولات وبادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع محولات NEBNext الفريدة ذات الفهرس المزدوج UMI لتقنية Illumina. للاطلاع على قائمة كاملة بالأوليغومرات المتوافقة، راجع العمود الأيمن من مخطط اختيار أوليغومرات NEBNext® المتعددة. تحتوي أدلة محولات NEBNext الفريدة ذات الفهرس المزدوج UMI أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات الربط. للاستخدام مع مجموعات تحضير مكتبات NEBNext، راجع دليل مجموعة تحضير المكتبات. للاطلاع على خيارات موازنة الألوان، يُرجى مراجعة مُحدد أوليغومرات NEBNext® الفهرسية للاطلاع على تركيبات الباركود الصالحة.