نيو إنجلاند بيولابس، E7546L، وحدة إصلاح الأطراف/إضافة ذيل الأدينين NEBNext® Ultra™ II

هذه الوحدة جزء من الفئات ذات الصلة : تحضير مكتبة الحمض النووي لتقنية Illumina، تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي لتقنية Illumina، مواصفات تحضير مكتبة التسلسل من الجيل التالي. المواد المطلوبة (غير المرفقة): حامل أو صفيحة مغناطيسية (مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext® (NEB #S1515S)، أو صفيحة Alpaqua® 96S Super Magnet Plate (#A001322)، أو ما يعادلها). الأسئلة الشائعة : س: هناك 3 وحدات ربط NEBNext، وهي وحدة الربط NEBNext Ultra II (#E7595)، ووحدة الربط NEBNext Ultra (#E7445)، ووحدة الربط السريع NEBNext (#E6056). أي وحدة يجب استخدامها مع وحدة إصلاح النهايات/إضافة ذيل dA في NEBNext Ultra II؟ ج: يجب استخدام وحدة إصلاح النهايات/إضافة ذيل dA في NEBNext Ultra II مع سير عمل Ultra II. صُممت هذه الوحدة للاستخدام مع وحدة الربط NEBNext Ultra II (#E7595) وهي متوافقة مع سير عمل Ultra II. أما وحدة الربط NEBNext Ultra (#E7445) ووحدة الربط السريع NEBNext (#E6056) فهما غير متوافقتين مع سير عمل Ultra II. س: كيف أنظف التفاعل بعد اكتماله؟ ج: صُممت الوحدة لتُركب مباشرةً في وحدة الربط NEBNext Ultra II (#E7595)، لذا لا حاجة لخطوة تنظيف. للاستخدام مع سير عمل غير Ultra II، اتبع البروتوكول التالي للتنظيف باستخدام خرز SpriSelect أو AMPure XP® (شركة Beckman Coulter): عند استخدام خرز AMPure XP، اترك الخرز ليصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. رج الخرز جيدًا لإعادة تعليقه. أضف 108 ميكرولتر (1.8 ضعف) من الخرز المُعلق إلى تفاعل الربط. امزج المكونات جيدًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي أو عن طريق سحب المحلول ودفعه بالماصة عشر مرات على الأقل. حضّن المزيج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنبوب/صفيحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على حامل مغناطيسي مناسب لفصل الخرز عن السائل الطافي. بعد أن يصبح المحلول صافيًا (حوالي 5 دقائق)، أزل السائل الطافي وتخلص منه بحرص. احرص على عدم تحريك الخرز الذي يحتوي على جزيئات الحمض النووي المستهدفة. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول المُحضر حديثًا بتركيز 80% إلى الأنبوب/صفيحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أثناء وجودها على الحامل المغناطيسي. حضّن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية، ثم أزل السائل الطافي وتخلص منه بحرص. كرر الخطوة 6 مرة واحدة. جفف الخرز بالهواء لمدة 5 دقائق بينما لا يزال الأنبوب/صفيحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على الحامل المغناطيسي مع فتح الغطاء. تنبيه: لا تجفف الخرز أكثر من اللازم، فقد يؤدي ذلك إلى انخفاض كمية الحمض النووي المستهدف المستخلص. أزل الأنبوب/الصفيحة من الحامل المغناطيسي. استخلص الحمض النووي المستهدف من الخرز بإضافة 47 ميكرولتر من محلول Tris-HCl بتركيز 10 ملي مولار أو محلول TE بتركيز 0.1X. امزج جيدًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي أو عن طريق سحب المحلول ودفعه عدة مرات باستخدام الماصة، ثم حضّنه لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنبوب/صفيحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الحامل المغناطيسي حتى يصبح المحلول صافيًا. دون تحريك حبيبات الخرز، انقل 42 ميكرولترًا من السائل الطافي بعناية إلى أنبوب طرد مركزي صغير معقم وجديد. س: هل يمكنني تخزين التفاعل بعد انتهائه في جهاز التدوير الحراري (أي عند وصوله إلى درجة حرارة 4 درجات مئوية)؟ ج: إذا لزم الأمر، يمكن تخزين العينات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية؛ ومع ذلك، قد يُلاحظ انخفاض طفيف في المردود (حوالي 20%). نوصي بمتابعة ربط المحولات أو تنظيف التفاعل قبل إيقافه. س: ماذا أفعل إذا رأيت راسبًا في محلول التفاعل Ultra II End Prep؟ ج: من الشائع رؤية راسب أبيض في محلول Ultra II End Repair. إذا حدث ذلك، اترك الخليط حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم اسحب المحلول عدة مرات باستخدام الماصة لتفتيت الراسب، ثم قم بالخلط السريع باستخدام جهاز الخلط الدوامي.