مجموعة نيو إنجلاند بيولابس E7630S، NEBNext® Library Quant Kit لـ Illumina®

يُعدّ التحديد الكمي الدقيق لمكتبات التسلسل من الجيل التالي (NGS) أمرًا بالغ الأهمية لزيادة إنتاج البيانات وجودتها إلى أقصى حد من كل عملية تسلسل. للاطلاع على فئات Illumina ذات الصلة ، بما في ذلك التحديد الكمي لمكتبات NGS، ومواصفات تحضير مكتبات التسلسل من الجيل التالي ، والمواد المطلوبة (غير المرفقة): ماء خالٍ من النيوكلياز، وجهاز qPCR، وألواح وأختام qPCR، وأنابيب شرائح PCR أو أنابيب الطرد المركزي الدقيقة، وأنابيب الطرد المركزي المخروطية. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين المعايير الستة الجديدة والمعايير الأربعة القديمة؟ ج: المعايير الستة الجديدة هي توسيع للمعايير الأربعة القديمة، مما يزيد نطاق التحديد الكمي الديناميكي بمقدار 100 ضعف، من 0.01 بيكومولار - 10 بيكومولار إلى 0.001 بيكومولار - 100 بيكومولار. يرجى ملاحظة أن المعايير الجديدة 2 و3 و4 و5 تُعادل المعايير القديمة 1 و2 و3 و4 (مع أرقام NEB #E7534 و#E7535 و#E7536 و#E7537 على التوالي). س: ما هي مزايا مجموعات NEBNext Library Quant القائمة على تقنية qPCR مقارنةً بالطرق الأخرى لتحديد كمية مكتبات NGS؟ ج: تُعتبر تقنية qPCR الطريقة الأكثر دقة وفعالية لتحديد كمية المكتبات. تتميز هذه التقنية باتساق ودقة أعلى بكثير في تحديد الكمية مقارنةً بالرحلان الكهربائي أو قياس الطيف الضوئي، اللذين يقيسان تركيز الحمض النووي الكلي. تُحدد الطرق القائمة على التضخيم كمية الجزيئات التي تحتوي على تسلسلي المحول فقط، مما يوفر تقديرًا أدق لتركيز المكتبة التي يمكن تسلسلها. ولأن تجارب qPCR يُمكن إجراؤها في صفائح ذات 96 بئرًا، فهي أيضًا أكثر ملاءمةً لسير العمل عالي الإنتاجية. مقارنةً بطرق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الأخرى، أُدخلت عدة تحسينات إضافية على مجموعات NEBNext Library Quant لزيادة سهولة الاستخدام: تأتي هذه المجموعات مع محلول تخفيف مركز وسهل الاستخدام. صُممت خلطات qPCR الرئيسية بحيث لا تتطلب سوى إضافة البادئات (لا حاجة إلى إضافة الماء إلى كل تفاعل). يمكن استخدام وقت تمديد واحد لجميع المكتبات، بغض النظر عن حجمها. س: ما هي المكتبات التي يمكن قياس كميتها باستخدام مجموعة NEBNext® Library Quant Kit لـ Illumina®؟ ج: يمكن قياس كمية أي مكتبة تحتوي على تسلسلات محولات Illumina P5 وP7 القياسية باستخدام هذه المجموعة. يمكن تحضير المكتبات باستخدام أي طريقة مطلوبة طالما تم إدخال تسلسلات المحولات هذه. تم إجراء عملية التحديد الكمي باستخدام مجموعة Quant Kit بنجاح باستخدام عدد من مجموعات بناء المكتبات، بما في ذلك تلك المدرجة أدناه: الشركة المصنعة، مجموعة تحضير المكتبة، نيو إنجلاند بيولابس®، NEBNext® Ultra™ II DNA، NEBNext Ultra II FS، NEBNext Enzymatic Methyl-seq (EM-seq™)، NEBNext Immune Sequencing، NEBNext ARTIC SARS-CoV-2، NEBNext Ultra II Directional RNA، NEBNext Ultra II RNA، NEBnext Single Cell/Low Input RNA، كلونتك SMARTer® Stranded Total RNA، KAPA™ Hyper HyperPlus، ثيرمو ساينتيفيك® MuSeek، إلومينا® Nextera Rapid Capture ScriptSeq™ v2، TruSeq DNA PCR-free، TruSeq Nano®، TruSeq RNA v2، TruSeq RNA Access، TruSight® Rapid Capture Illumina PCR-free، تاكارا بريب™، ILM DNA. مجموعة واسعة من المواد الجينومية المدخلة متوافقة مع مجموعة Quant Kit. تم التحقق من أداء المجموعة باستخدام مكتبات يتراوح حجمها بين 140 و1000 زوج قاعدي، ونسبة محتوى GC فيها بين 20 و70%. يمكن أن تكون المادة المدخلة عبارة عن sRNA، أو DNA من عينات FFPE، أو مكتبات gDNA من أي مصدر مطلوب، بما في ذلك المكتبات ذات نسب GC المتطرفة، مثل بلازموديوم ورودوبسودوموناس. س: ما مقدار التخفيف المطلوب لمكتبتي قبل تشغيلها في مجموعة Quant؟ ج: نوصي بتخفيف المكتبة مبدئيًا بنسبة 1:1000 باستخدام محلول تخفيف المكتبة المرفق. بالنسبة لمعظم تحضيرات المكتبات، سينتج عن ذلك تركيز مكتبة يزيد عن 10 بيكومولار، لذا نوصي بإجراء تخفيفين متسلسلين إضافيين بنسبة 1:10، ليصل التركيز النهائي إلى 1:10000 و1:100000. بالنسبة للبروتوكولات والمكتبات الجديدة، نوصي بتشغيل كلا التخفيفين في مجموعة Quant. مع سير العمل الأكثر رسوخًا أو لزيادة عدد المكتبات المراد قياسها، غالبًا ما يكون من الممكن استخدام التخفيف 1:100,000 فقط للقياس الكمي. في حال الرغبة في تخفيفات مخصصة، يُرجى التأكد من أن المكتبات المخففة النهائية تقع ضمن نطاق المعايير، من 100 بيكومولار إلى 1 فيمتومولار. س: هل يمكنني تشغيل مجموعة NEBNext Library Quant Kit على جهاز qPCR الخاص بي؟ ج: مجموعة Quant Kit متوافقة مع جميع أجهزة qPCR التي تم اختبارها حتى الآن، باستخدام بروتوكولات رفع درجة الحرارة القياسية أو السريعة. بالنسبة للأجهزة التي تستخدم صبغة مرجعية للتطبيع، يُرجى الرجوع إلى دليل المجموعة أو الأسئلة الشائعة حول ROX لاختيار ROX المناسب. تم تشغيل مجموعة Quant Kit بنجاح على أجهزة qPCR التالية: الشركة المصنعة، الجهاز: Applied Biosystems® StepOne™، StepOnePlus™، Prism® 7000، Prism 7900HT، 7500 Fast، ViiA™ 7، Bio-Rad iQ® 5، CFX96™، CFX384™، Life Technologies QuantStudio™ 7، Roche LightCycler® 96، LightCycler 480. يرجى التواصل معنا عبر البريد الإلكتروني info@neb.com إذا كنتم ترغبون في مناقشة الأداء على أي جهاز qPCR غير مدرج أعلاه. س: أي صبغة ROX يجب أن أستخدمها مع جهاز qPCR الخاص بي؟ ج: نوفر أنابيب منفصلة من صبغة ROX المعيارية بتركيزين (منخفض، مرتفع) لتمكين استخدامها على جميع منصات qPCR. يرجى الرجوع إلى الجدول أدناه لتحديد ما إذا كان استخدام ROX مطلوبًا، وإذا كان الأمر كذلك، فما هو التركيز المطلوب: جهاز qPCR ROX Bio-Rad® iQ™5، CFX96، CFX384، Opticon Roche Lightcycler® Qiagen Rotor-Gene™ Eppendorf Mastercycler® Cepheid® SmartCycler® غير مُوصى به Applied Biosystems® 7500، QuantStudio™، ViiA7™ Agilent Mx™ تركيز منخفض ROX Applied Biosystems® 7000، 7300، 7700، 7900HT، StepOne™، StepOnePlus™ تركيز عالٍ ROX س: هل تكفي 4 معايير لتحديد كمية qPCR؟ ج: نعم. على الرغم من أننا نوصي باستخدام 6 معايير (100 بيكومولار - 0.001 بيكومولار)، فإن منحنيات المعايرة المُنشأة من 4 معايير (10 بيكومولار - 0.01 بيكومولار) كافية لإعطاء قياس موثوق لتركيز المكتبة. حتى لو كان أحد المعايير شاذًا عن المنحنى بسبب مشاكل في الإعداد، يمكن استخدام المعايير الثلاثة الأخرى بثقة. يغطي نطاق تركيزات المعايير المرفقة مع المجموعة جميع المكتبات المُحضّرة باستخدام الطرق والمجموعات القياسية التي تتبع إرشادات المجموعة لتحضير تخفيفات المكتبات. س: هل يتطلب تحديد كمية المكتبة تصحيحًا للحجم؟ ج: نعم. يرتبط الصبغ المتداخل المستخدم في المجموعة بالحمض النووي DNA بما يتناسب مع عدد أزواج القواعد لكل منتج DNA مزدوج السلسلة، لذا من الضروري تصحيح طول المنتج عن طريق معايرته وفقًا لحجم معيار DNA، وهو 399 زوجًا من القواعد. تُضرب جميع الكميات ببساطة في عامل تصحيح، 399/حجم المكتبة. يتم ذلك تلقائيًا باستخدام أداة الحاسبة الإلكترونية الخاصة بنا. س: ما هي المواد/المعلومات الأخرى التي أحتاجها لتشغيل مجموعة NEBNext® Library Quant Kit؟ ج: من الضروري معرفة متوسط ​​حجم المكتبة، لذا فإن التحليل باستخدام جهاز Agilent Bioanalyzer أو TapeStation أو جهاز مشابه يُعد مفيدًا. يُرفق محلول تخفيف مركز للمكتبة، ويجب تخفيفه باستخدام ماء خالٍ من النيوكلياز. يلزم جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) مع الألواح والأغطية المناسبة، بالإضافة إلى معدات المختبر القياسية مثل الماصات، ورؤوس الماصات، والأنابيب المخروطية. س: كم عدد المكتبات التي يمكنني قياس كميتها في المرة الواحدة؟ ج: نوصي بإجراء تخفيفين لكل مكتبة، وتكرار كل تخفيف ثلاث مرات. بالتالي، يمكن قياس كمية 12 مكتبة (باستخدام 6 معايير) أو 13 مكتبة (باستخدام 4 معايير) في لوحة 96 بئرًا. بمجرد ترسيخ آلية العمل، يمكن إجراء تخفيف واحد، مما يسمح بقياس كمية 25 مكتبة (باستخدام 6 معايير) أو 27 مكتبة (باستخدام 4 معايير) لكل لوحة 96 بئرًا. س: ما هي مدة تشغيل مجموعة Quant Kit؟ ج: نقدر إجمالي وقت التشغيل من البداية إلى النهاية بساعة و45 دقيقة. من هذا الوقت، يقل وقت العمل اليدوي عن 45 دقيقة، بينما تستغرق ساعة واحدة من وقت تشغيل الجهاز لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). س: هل توفرون أي أدوات تحليلية للمساعدة في التحديد الكمي؟ ج: نعم، لدينا حاسبة بسيطة لتحديد كمية مكتبة qPCR ضمن مجموعة أدوات NEBioTools. لاستخدام أداة تحديد كمية qPCR، تحتاج فقط إلى قيمة Cq لكل معيار ومكتبة، ومعامل التخفيف لكل عينة، وحجم المكتبة لتصحيح الحجم. الأداة مكتفية ذاتيًا ولا تغادر البيانات متصفحك. س: هل يمكنني رؤية ثنائيات المحولات كمقياس لجودة المكتبة؟ ج: نعم. على الرغم من أن منحنى الذوبان ليس مطلوبًا لهذه المجموعة، وحذفه سيقلل من أوقات التشغيل، إلا أنه يمكن استخدام بيانات تحليل الذوبان للحصول على معلومات حول جودة المكتبة. عندما تكون ثنائيات المحولات موجودة بنسبة تزيد عن 5% من عينة المكتبة، يمكن ملاحظة قمة ذوبان حادة واحدة عند 81.5 درجة مئوية. في جميع الحالات الأخرى، سيتم إنتاج منحنى ذوبان عريض أو متعدد القمم، مما يدل على نطاق وتنوع المكتبة التي يتم تضخيمها. س: ما هي مدة صلاحية المزيج الرئيسي بعد إضافة البادئات؟ ج: بمجرد إضافة بادئات مجموعة Quant إلى المزيج الرئيسي، يصبح محلول المزيج + البادئات مستقرًا لمدة 6 أسابيع عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لسهولة الاستخدام. إذا كنت تتوقع فترات أطول بين عمليات التشغيل، فقم بتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أشهر. س: هل يمكن شراء محلول تخفيف مكتبة NEBNext بشكل منفصل؟ ج: نعم، بالإضافة إلى محلول التخفيف المتوفر في المجموعة، يمكن شراؤه بشكل منفصل. رقم القطعة هو B6118S. وهو عبارة عن زجاجة سعة 7.5 مل ويمكن شراؤها من هنا.