نيو إنجلاند بيولابس، E7645L، مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext® Ultra™ II لتقنية Illumina®

هل تواجه صعوبة في محاولة الحصول على إنتاجية أعلى للمكتبة باستخدام كميات مدخلات متناقصة باستمرار؟ كل مكون في فئات NEBNext ذات الصلة : التحقق من صحة تحرير الجينات القائم على تقنية CRISPR، تحضير مكتبة الحمض النووي لتقنية Illumina، تحليل الكروماتين، المواصفات . المواد المطلوبة ولكن غير المرفقة: 80% إيثانول (مُحضر حديثًا)، ماء خالٍ من النيوكلياز، محلول TE بتركيز 0.1X (1 مليمولار Tris-HCl، درجة الحموضة 8.0، 0.1 مليمولار EDTA)، أنابيب ربط الحمض النووي LoBind (Eppendorf #022431021)، قليل النوكليوتيدات NEBNext أحادية أو متعددة لتقنية Illumina (NEB #E7350، #E7335، #E7500، #E7600، #E6609، #E7710، أو #E7730)، حامل أو صفيحة مغناطيسية (مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext® (NEB #S1515S)، أو صفيحة Alpaqua® 96S المغناطيسية الفائقة (#A001322)، أو (مكافئ) جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لجهاز NEB رقم E7645 فقط: مجموعة كواشف SPRIselect® (شركة Beckman Coulter، رقم B23317) أو خرز AMPure® XP (شركة Beckman Coulter، رقم A63881). اختياري: محلول Tris-HCl بتركيز 10 ملي مولار، ودرجة حموضة 8.0، أو محلول Tris/NaCl بدرجة حموضة 8.0 (10 ملي مولار Tris، 10 ملي مولار NaCl) (لتخفيف مُهايئ مدخلات الحمض النووي ≤ 100 نانوغرام). الأسئلة الشائعة : س: ما نوع تحضير العينات/بناء المكتبة الذي يُمكنني استخدام مجموعة NEBNext Ultra II لتحضير مكتبة الحمض النووي لـ Illumina معه؟ ج: تتوافق مجموعة NEBNext Ultra II لتحضير مكتبة الحمض النووي لـ Illumina مع البروتوكولات التي تتطلب وجود امتداد 3´ A على جزيئات المكتبة لتسهيل الربط بالمُهايئات التي تحتوي على امتداد 5´ T، مثل تحضير المكتبة للتسلسل على منصة Illumina. في الوقت الحالي، تم التحقق من صحة مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي Ultra II على منصة Illumina فقط. س: ما نوع وكمية المادة الأولية التي أحتاجها عند تحضير المكتبات باستخدام مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي Ultra II من NEBNext لمنصة Illumina؟ ج: يُوصى باستخدام 500 بيكوغرام إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي المقطّع. س: هل اختيار الحجم ضروري، وما هي الطريقة المُوصى بها؟ ج: نعم، نوصي باختيار الحجم باستخدام خرز SPRIselect أو AMPure XP عند تحضير المكتبات من مدخلات الحمض النووي التي تزيد عن 50 نانوغرام. يتضمن الدليل بروتوكولًا مفصلًا لاختيار الحجم، حيث يتراوح حجم شظايا الحمض النووي من 150 زوجًا قاعديًا إلى 500-700 زوجًا قاعديًا (حجم المكتبة النهائي 250-800 زوجًا قاعديًا). تتوافق مجموعة Ultra II أيضًا مع طرق اختيار الحجم الأخرى، بما في ذلك هلام الأغاروز وهلام E. لا يُوصى باختيار الحجم إذا كانت مدخلات الحمض النووي أقل من أو تساوي 50 نانوغرام. س: هل يمكنني استخدام مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي NEBNext Ultra II لكواشف Illumina لتحضير المكتبات للتسلسل على جهاز Ion Torrent PGM أو Proton؟ ج: لا. المحولات المرفقة مع جهاز ThermoFisher Ion Torrent لها نهايات غير لاصقة وليست ذات نهايات 5'-T بارزة. س: هل هذه الكواشف متوفرة بتنسيق مخصص، أو بتنسيق أكبر، أو بتنسيق 96 بئرًا؟ ج: نعم، يمكننا توفير تنسيقات مخصصة. يرجى التواصل مع قسم تصنيع المعدات الأصلية (OEM) لدينا على custom@neb.com لمزيد من التفاصيل. س: كيف أعرف تركيز بادئات الفهرسة الخاصة بي؟ ج: بالنسبة لبادئات الفهرسة الموجودة في الأنابيب، فإن الأرقام الأربعة الأخيرة من رقم الدفعة هي سنة وشهر إصدار دفعة المجموعة. أي مجموعة صدرت في ديسمبر 2014 أو بعده (رقم الدفعة ينتهي بـ 1412) يكون تركيزها 10 ميكرومولار، وأي مجموعة صدرت قبل ديسمبر 2014 يكون تركيزها 25 ميكرومولار. بالإضافة إلى ذلك، تتم طباعة التركيزات الآن على ملصقات الأنابيب. جميع البادئات المُفهرسة المُرفقة في الألواح بتركيز 10 ميكرومتر. س: هل يُمكنني استخدام مجموعة NEBNext هذه مع مُحولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB؟ ج: نعم، يُمكن استخدام مُحولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB مع مجموعة NEBNext هذه. يجب أن يكون المُحول من نوع T overhang، وقد يكون ناتج المكتبة النهائي أقل قليلاً من الناتج عند استخدام مُحولات NEBNext الخاصة بـ Illumina®. تتوفر تعليمات الاستخدام مع المُحولات غير التابعة لـ NEBNext، والمُشفرة بالكامل، وبادئات P5 وP7 العالمية لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في أدلة مُحولات NEBNext المُفهرسة/UMI. يُمكن العثور على هذه الأدلة على الموقع الإلكتروني neb.com/E7416 (RNA) أو neb.com/E7395 (DNA). اختر دليل مجموعة NEBNext التي ستستخدمها. كُتبت هذه الأدلة خصيصًا لمحولات NEBNext المفهرسة/UMI، وينبغي أن يعمل البروتوكول نفسه مع محولات أخرى ذات تصميم مشابه. نوصي بإجراء تجربة أولية باستخدام مجموعة تحضير المكتبة المطلوبة والمحولات المفهرسة المطلوبة، واستخدام عينات قابلة للاستهلاك لتحسين ظروف التجربة. س: ماذا أفعل إذا رأيت راسبًا في محلول تفاعل تحضير النهاية Ultra II؟ ج: من الشائع رؤية راسب أبيض في محلول إصلاح النهاية Ultra II. في هذه الحالة، اترك الخليط حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم الماصة عدة مرات لسحب المحلول وتفتيت الراسب، ثم قم برجّه سريعًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. س: هل تتضمن المجموعة محولات وبادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع NEBNext Multiplex Oligos for Illumina. للاطلاع على القائمة الكاملة، راجع مخطط اختيار NEBNext® Multiplex Oligos. للاستخدام مع مجموعات تحضير مكتبة NEBNext، راجع دليل مجموعة تحضير المكتبة. تحتوي كتيبات مجموعة أوليغومرات المتعددة أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات البلمرة المتسلسلة (PCR). للاطلاع على خيارات موازنة الألوان، يُرجى مراجعة مُحدد أوليغومرات فهرس NEBNext® للاطلاع على تركيبات الباركود الصالحة.