نيو إنجلاند بيولابس، E7658L، NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina®)

تم إيقاف إنتاج الحجم الصغير من هذا المنتج في 15 ديسمبر 2024. وسيظل الحجم الكبير (NEB #E7658L) متاحًا. الفئات ذات الصلة: منتجات NEBNext® ARTIC لتسلسل SARS-CoV-2. المواصفات: المواد المطلوبة (غير متوفرة) : NEBNext Singleplex أو Multiplex Oligos لـ Illumina - www.neb.com/oligos، إيثانول 80% (مُحضر حديثًا)، ماء خالٍ من النيوكلياز، أنابيب DNA LoBind (Eppendorf®#022431021)، حامل مغناطيسي (NEB #S1515، Alpaqua®، رقم المنتج A001322 أو ما يعادله)، جهاز تدوير حراري، خلاط دوامي، جهاز طرد مركزي دقيق، Agilent®Bioanalyzer® أو محلل شظايا مشابه والمواد الاستهلاكية المرتبطة به، DNase، أنابيب شرائح PCR خالية من RNase (USA Scientific®1402-1708). الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين مزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 ومزيج بادئات NEBNext VarSkip Short الأصلي؟ ج: مزيج بادئات SARS-CoV-2؟ ج: تم تحسين مزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 لزيادة تغطية متحور أوميكرون. في هذا المزيج v2، تم استبدال 10 بادئات، مما أثر على 7 أزواج من البادئات. س: ما الفرق بين مزيج بادئات NEBNext VarSkip v2 Short SARS-CoV-2 ومزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2؟ ج: يعتمد مزيجا VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 1 و2 لتضخيم جينوم SARS-CoV-2 على تسلسلات hCoV-2019/nCoV-2019 الإصدار 3 (v3) مع تراكيز متوازنة من البادئات. صُممت مجموعتا NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2، 1 و2، لتضخيم جينوم فيروس SARS-CoV-2، بهدف تقليل تأثير المتغيرات على كفاءة التضخيم. يبلغ طول مُضخّمات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 حوالي 400 زوج قاعدي، بينما يبلغ طول مُضخّمات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 حوالي 550 زوج قاعدي. س: أين يمكنني العثور على معلومات تسلسل البادئات لمجموعتي NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 وNEBNext ARTIC SARS-CoV-2؟ ج: يمكن العثور على تسلسلات بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 هنا: https://github.com/nebiolabs/VarSkip، ويمكن العثور على تسلسلات بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 هنا: https://github.com/joshquick/artic-ncov2019/blob/master/primer_schemes/nCoV-2019/V3/nCoV-2019.tsv. س: هل يمكن إضافة مزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 ومزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 إلى نفس تفاعل التضخيم المستهدف؟ ج: لا، لا يمكن إضافة مزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 ومزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 إلى نفس تفاعل التضخيم. س: أيّ نظام بادئات يجب أن أستخدم: مزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 أم مزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2؟ ج: يُوصى باستخدام مزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 لعينات SARS-CoV-2 المعروفة أو المتوقعة. س: هل تغطي بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 عينات SARS-CoV-2 غير المتحورة؟ ج: نعم، يمكن استخدامها أيضًا لتضخيم عينات SARS-CoV-2 غير المتحورة. س: ما هي متحورات SARS-CoV-2 التي تغطيها بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2؟ ج: صُممت بادئات VarSkip Short SARS-CoV-2 القصيرة لتكون مقاومة للمتحورات. لقد تأكدنا من أن هذه البادئات توفر تغطية جينومية عالية للمتغيرات التالية: B.1.351 (بيتا)، P.1. (جاما)، B1.617.1 (كابا)، B.1.617.2 (دلتا)، B.1.617.3، BA.1 (أوميكرون)، BA.2 (أوميكرون). س: هل يمكن إضافة أزواج بادئات التحكم البشري NEBNext ARTIC ومزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 إلى نفس تفاعل التضخيم المستهدف؟ ج: نعم، زوجا بادئات التحكم البشري NEBNext ARTIC 1 و2 هما ضوابط داخلية اختيارية. في حال استخدامهما، يجب دمج أزواج بادئات التحكم البشري NEBNext ARTIC المناسبة ومزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 قبل الاستخدام. يمكن دمج أزواج البادئات البشرية للتحكم 1 مع مزيج البادئات NEBNext ARTIC NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 1، كما يمكن دمج أزواج البادئات البشرية للتحكم 2 مع مزيج البادئات NEBNext ARTIC NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 2. تُنتج أزواج البادئات البشرية للتحكم من NEBNext ARTIC قطعًا مضخمة بطول 400 زوج قاعدي، بينما يبلغ طول قطع VarSkip Short v2 المضخمة حوالي 550 زوج قاعدي. بعد التجزئة الأنزيمية، يبلغ حجم كل من قطع التحكم البشري وقطع VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 حوالي 120 زوج قاعدي. س: كيف يمكنني تحليل بيانات تسلسل VarSkip Short v2 SARS-CoV-2؟ ج: يمكن تحليل بيانات تسلسل VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 باستخدام نفس طرق التحليل المستخدمة في تسلسل القطع المضخمة المتعددة ARTIC. جميع ملفات المراجع اللازمة لتعديل مسارات تحليل تسلسل ARTIC لتحليل تسلسل VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 موجودة على الرابط التالي: https://github.com/nebiolabs/VarSkip. س: هل تسلسلات البادئات في مزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 هي نفسها تسلسلات بادئات ARTIC Network V3؟ ج: نعم، التسلسلات متطابقة، ويمكن الاطلاع عليها هنا. تمّت موازنة البادئات في مزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 باستخدام منهجية طُوّرت في NEB استنادًا إلى بيانات تجريبية من التسلسل، وذلك لتحقيق تغطية أكثر تجانسًا عبر الجينوم. س: ما هو طول القراءة الموصى به لتسلسل المكتبات المُنشأة باستخدام مجموعة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS (Illumina)؟ ج: يبلغ طول المكتبات المُنشأة باستخدام هذه المجموعة 200-270 زوجًا قاعديًا، بما في ذلك التسلسلات الخاصة بتقنية Illumina. يُوصى بإجراء تسلسل مزدوج الأطراف بطول 75 زوجًا قاعديًا (2 × 75 زوجًا قاعديًا) لتغطية طول الجزء المُدخل. س: كم عدد قراءات التسلسل التي أحتاجها لتسلسل المكتبات المُنشأة باستخدام مجموعات NEBNext ARTIC لتقنية Illumina؟ ج: يعتمد عدد القراءات المطلوبة على جودة وكمية المادة الأولية. نوصي بالبدء بـ 0.5 مليون قراءة لضمان تغطية كافية. بعد التحليل، يمكن تعديل عدد القراءات في عمليات التسلسل اللاحقة وفقًا لعيناتك. س: ما هي قيم Ct المُوصى بها للمدخلات المستخدمة مع مجموعات NEBNext ARTIC لتقنية Illumina؟ ج: يُوصى باستخدام عينات ذات قيم Ct أقل من 32. س: كيف يُمكنني تحليل البيانات من المكتبات المُنشأة باستخدام مجموعات NEBNext ARTIC لتقنية Illumina؟ ج: تتوافق بيانات التسلسل الناتجة مع عدد من أدوات التحليل، بما في ذلك https://nf-co.re/viralrecon و https://covid19.galaxyproject.org/artic/. ولتحقيق أقصى قدر من فعالية تحديد المتغيرات في هذا النهج المتداخل لتضخيم الحمض النووي، يُوصى بإخفاء مناطق البادئات على أزواج القراءات (وليس المرجع). من المهم مراعاة كلا الزوجين عند تحديد القواعد التي يجب أخذها في الاعتبار عند تقييم المتغيرات. قد تُعزى مناطق التغطية المنخفضة إلى وجود قواعد متغيرة في منطقة البادئات. يمكن استخدام التضخيمات المتجاورة للتمييز بين هذه الأحداث الناتجة عن المتغيرات والتغير العشوائي في التغطية. س: ما هي محولات وبادئات NEBNext الموصى باستخدامها مع مجموعات ARTIC لـ Illumina؟ أ: الأجهزة: NextSeq 1000/2000، NovaSeq، أي جهاز يعاني من مشاكل في قفز الباركود. التوصية: أي من مجموعات NEBNext Multiplex Oligos الأربعة لـ Illumina (أزواج البادئات الفريدة ذات الفهرس المزدوج) من 1 إلى 4: E6440، E6442، E6444، E6446. أقل من 96 عينة: اشترِ الحجم S. 96 عينة فأكثر: تعتمد التوصية على عدد العينات التي يخطط المستخدم لتجميعها لكل عملية تسلسل: إذا كان تجميع أكثر من 96 عينة لعملية واحدة، فسيحتاج المستخدمون إلى مجموعات UDI متعددة. هذا أكثر احتمالًا مع الأجهزة عالية الإنتاجية مثل NovaSeq. إذا لم يتم تجميع 96 عينة أو أكثر معًا لعملية واحدة، يُوصى بالحجم L لمجموعة واحدة. الأجهزة: MiSeq وNextSeq 500/550. التوصية: يمكن استخدام أي منتج من منتجات NEBNext Oligos. إذا كان هناك أي احتمال لتسلسل المكتبات على NextSeq أو NovaSeq، يُوصى بمجموعات الفهرس المزدوج الفريدة. أقل من 96 عينة: إذا كانت أجهزة MiSeq هي المتاحة فقط، وتم تجميع أقل من 96 عينة، فإن مجموعة البادئات أحادية الفهرسة المكونة من 96 بادئة (E6609) هي الأنسب للاستخدام. 96 عينة فأكثر: يمكن استخدام جميع منتجات NEBNext Oligos، ويجب على المستخدمين تحديد تنسيق المنتج المفضل لديهم. توصية جهاز MiniSeq: يمكن استخدام أي منتج من منتجات NEBNext Oligos. إذا كان هناك احتمال لتسلسل المكتبات على NextSeq أو NovaSeq، يُوصى باستخدام مجموعات الفهرسة المزدوجة الفريدة. أقل من 96 عينة: إذا كانت أجهزة MiniSeq هي المتاحة فقط، وتم تجميع أقل من 96 عينة، فإن مجموعة البادئات أحادية الفهرسة المكونة من 96 بادئة (E6609) هي الأنسب للاستخدام. 96 عينة فأكثر: يمكن استخدام جميع منتجات NEBNext Oligos، ويجب على المستخدمين تحديد تنسيق المنتج المفضل لديهم. سؤال: هل أحتاج إلى إضافة PhiX إلى عملية التسلسل؟ جواب: المكتبات المُنشأة بهذه الطريقة معقدة بما يكفي بحيث لا يكون PhiX ضروريًا لزيادة التعقيد. مع ذلك، يُنصح بإضافة PhiX بنسبة تزيد عن 1% كإجراء لمراقبة جودة عملية التسلسل. س: هل أحتاج إلى معايرة تركيز المكتبة قبل التسلسل؟ ج: لتحسين عدد قراءات التسلسل المُحصلة لكل مكتبة، يُنصح بالمعايرة قبل التسلسل. مع ذلك، قد لا تكون المعايرة ضرورية لهذه الطريقة. لقد تلقينا ملاحظات من مستخدمين حصلوا على نتائج جيدة دون معايرة. س: ما هو تركيز التحميل النهائي المطلوب لمنصات التسلسل MiSeq® وNextSeq® 500/550 Illumina®؟ ج: يعتمد تركيز التحميل النهائي على جهاز Illumina وكواشف التسلسل. بالنسبة لتسلسل MiSeq باستخدام كواشف V2 أو V3، نوصي بتركيز 8-10 بيكومولار. أما بالنسبة لـ NextSeq 500/550، فنوصي بتركيز 1.2-1.4 بيكومولار. س: هل يجب أن تكون عينة الحمض النووي الريبوزي الكلي خالية من الحمض النووي قبل بدء سير عمل ARTIC؟ ج: لا، ليس من الضروري أن يكون الحمض النووي الريبوزي (RNA) خاليًا من الحمض النووي (DNA) لإجراء عملية ARTIC. س: هل يمكن تحسين التغطية للطفرات الحديثة؟ ج: نعم، تم تصميم واختبار بادئات داخلية لمعالجة مناطق التغطية المنخفضة الناتجة عن طفرات KP وJN. يمكن توفير هذه البادئات مجانًا عند الطلب. يرجى التواصل عبر البريد الإلكتروني info@neb.com. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام التسلسلات أدناه لتصنيع بادئات مخصصة من مزود الأوليغونوكليوتيدات المفضل لديك. يجب استخدام هذه البادئات الداخلية مع بادئات VarSkip Short v2 باتباع البروتوكولات الموضحة أدناه. تركيز تسلسل البادئات المستهدفة في مزيج VSSv2f Spike-in في 1xPool (ميكرومولار) 1 varskip-0317-1_1_LEFT_ALT3 ATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACG 0.5 1 varskip-0317-1_05_RIGHT_ALT2 GACAATTTCACAAGCACAGGTTGAG 0.5 1 varskip-0317-1_07_LEFT_ALT2 CCTCTAAAAGCCCCAAAAGAAATTATC 0.5 1 varskip-0317-1_09_RIGHT_ALT2 GTTTACTTTCAGTTATAAATGGCTTAACTTC 0.5 1 varskip-0317-1_11_LEFT_ALT2 GTGGCACTACTGAAATGCTAGC 0.5 1 varskip-0317-1_13_RIGHT_ALT2 TTCATAAGAAAGTGTGCCCATGTAC 0.5 1 varskip-0317-1_15_RIGHT_ALT1 GCTCCAAAGACAACGTATACACC 0.5 1 varskip-0317-1_35_LEFT_ALT2 GATGATTATTTCAATAAAAAGGACTGGTATG 0.5 1 varskip-0317-1_45_RIGHT_ALT2 ATTGATCTCCAGGCGGTGGTTT 0.5 1 49_R_ALT2 GTAATAAGAACACCATTACGGGCAT 0.5 1 varskip-0317-1_53_RIGHT_ALT2 TGAGGATCTGAAAACTTTGTCAGG 0.5 1 55_L_ALT1 CCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTT 0.5 1 varskip-0317-1_57_LEFT_ALT6 CTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGA 0.5 2 varskip-0317-1_24_LEFT_ALT2 GCCTTTAATACTTTACTATTCCTTATGTC 0.5 2 varskip-0317-1_28_RIGHT_ALT2 AGGCCAAAGTAACAAGTACAAAAATAGC 0.5 2 varskip-0317-1_32_RIGHT_ALT2 CTGTTATTGCCTGACCAGTACC 0.5 2 varskip-0317-1_34_RIGHT_ALT2 ATCACAGAATTGTACTGTTTTTAACAAAGC 0.5 2 varskip-0317-1_54_RIGHT_ALT2 CTTCAAGGTCCATAAGAAAAGGCT 0.5 2 56L_ALT1 TTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGG 0.5 2 varskip-0317-1_56_RIGHT_ALT2 CAGCCTGTAAAATCATCTGGTAATTTAT 0.5 بروتوكولات استخدام البادئات المُضافة: بالنسبة لمجموعات 96 تفاعلًا: قم بإذابة مزيج البادئات المُضافة VSSv2f 1، ومزيج البادئات المُضافة VSSv2f 2، ومزيج البادئات VSSv2 1، ومزيج البادئات VSSv2 2. اخلط جميع الأنابيب الأربعة وقم بتدويرها بسرعة. أضف 3 ميكرولتر من مزيج البادئات المُضافة VSSv2f 1 إلى مزيج البادئات VSSv2 1، وقم بالخلط باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم قم بالتدوير، وضع المزيج على الثلج. أضف 2.5 ميكرولتر من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 2 إلى مزيج VSSv2 Primer Mix 2، ثم رجّ المزيج جيدًا، ثم قم بالطرد المركزي، وضع المزيج على الثلج. استخدم مزيج VarSkip Short v2 Primer Mix 1 و2 المُدعّمين لبروتوكول RT-PCR. بالنسبة لمجموعات 24 تفاعلًا: قم بإذابة مزيج VSSv2f Spike-in Mix 1، ومزيج VSSv2f Spike-in Mix 2، ومزيج VSSv2 Primer Mix 1، ومزيج VSSv2 Primer Mix 2. امزج جميع الأنابيب الأربعة وقم بالطرد المركزي السريع. أضف 2 ميكرولتر من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 1 إلى 2 ميكرولتر من محلول TE بتركيز 0.1x لتحضير تخفيف ½ من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 1. أضف 1.5 ميكرولتر من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 1 المخفف إلى مزيج VSSv2 Primer Mix 1، ثم رجّ المزيج جيدًا، ثم قم بالطرد المركزي، وضع المزيج على الثلج. أضف 2 ميكرولتر من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 2 إلى 2 ميكرولتر من محلول TE بتركيز 0.1x لتحضير تخفيف ½ من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 2. أضف 1.25 ميكرولتر من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 2 المخفف إلى مزيج VSSv2 Primer Mix 2، ثم قم بالخلط باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم قم بالطرد المركزي، وضع المزيج على الثلج. استخدم مزيج VarSkip Short v2 Primer Mix 1 و2 المُضاف إليهما بادئات VarSkip Short v2 Primer Mix 1 و2 لبروتوكول RT-PCR. سؤال: هل ما زال بإمكاني تحضير مكتبات ARTIC-SARS-CoV-2 لتقنية Illumina بدون تجزئة إنزيمية؟ جواب: نعم. ستحتاج إلى المجموعات التالية لإعادة إنتاج منتجنا المتوقف E7650. E7626 وحدة NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 RT-PCR E7645 مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext® Ultra™ II لـ Illumina® E6440 NEBNext® Multiplex Oligos لـ Illumina (96 زوجًا فريدًا من البادئات ذات الفهرس المزدوج) اتبع دليل E7650 مع استبدال مزيج NEBNext Library PCR Master Mix بمزيج NEBNext Ultra II Q5 Master Mix.