نيو إنجلاند بيولابس، E7660L، مجموعة NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies®)

تم إيقاف إنتاج الحجم الصغير من هذا المنتج في 15 ديسمبر 2024. وسيظل الحجم الكبير (NEB #E7660L) متاحًا. الفئات ذات الصلة: تحضير مكتبة لتقنيات أوكسفورد نانوبور، منتجات NEBNext® ARTIC لتسلسل SARS-CoV-2، تحضير مكتبة الحمض النووي الريبي لـ Illumina، المواد المطلوبة ( غير متوفرة ): 80% إيثانول (مُحضر حديثًا)، أنابيب ربط الحمض النووي (Eppendorf #022431021)، مجموعات توسيع الترميز الأصلي من أوكسفورد نانوبور تكنولوجيز 1-12 (EXP-NBD104)، 13-24 (EXP-NBD114) أو 1-96 (EXP-NBD196)، مجموعة تسلسل الربط من أوكسفورد نانوبور تكنولوجيز (SQK-LSK109)، مجموعة توسيع SFB من أوكسفورد نانوبور تكنولوجيز (EXP-SFB001)، مجموعة فحص Qubit® dsDNA HS (ThermoFisher® Q32851)، حامل/رف مغناطيسي (NEB #S1515، Alpaqua®). (رقم المنتج A001322 أو ما يعادله) جهاز تدوير حراري، خلاط دوامي، جهاز طرد مركزي دقيق، جهاز تحليل الشظايا Agilent® Bioanalyzer® أو جهاز مشابه، والمواد الاستهلاكية المرتبطة به (نظام TapeStation 4150 أو 4200)، أنابيب شرائح PCR خالية من DNase وRNase (USA Scientific 1402-1708)، حامل مغناطيسي للأنابيب سعة 1.5 مل (NEB رقم S1506). الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين مزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 ومزيج بادئات NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 الأصلي؟ ج: تم تحسين مزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 لزيادة تغطية متغير Omicron. في هذا الإصدار الثاني، تم استبدال 10 بادئات، مما أثر على 7 أزواج من البادئات. س: ما الفرق بين مزيجَي البادئات NEBNext VarSkip v2 Short SARS-CoV-2 ومزيجَي البادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2؟ ج: يعتمد مزيجا VarSkip Short v2 SARS-CoV-2، 1 و2، لتضخيم جينوم SARS-CoV-2 على تسلسلات hCoV-2019/nCoV-2019 الإصدار 3 (v3) مع تراكيز متوازنة من البادئات. صُمِّمَ مزيجا NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2، 1 و2، لتضخيم جينوم SARS-CoV-2 لتقليل تأثير المتغيرات على كفاءة التضخيم. يبلغ طول مُضخَّمات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 حوالي 400 زوج قاعدي، بينما يبلغ طول مُضخَّمات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 حوالي 550 زوج قاعدي. س: أين يمكنني العثور على معلومات تسلسل البادئات لمزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 ومزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2؟ ج: يمكن العثور على تسلسلات بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 هنا: https://github.com/nebiolabs/VarSkip، ويمكن العثور على تسلسلات بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 هنا: https://github.com/joshquick/artic-ncov2019/blob/master/primer_schemes/nCoV-2019/V3/nCoV-2019.tsv س: هل يمكن إضافة مزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 ومزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 إلى نفس تفاعل التضخيم المستهدف؟ س: هل يمكن استخدام مزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 أو مزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 في تفاعل التضخيم نفسه؟ ج: لا، لا يمكن استخدام مزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 أو مزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 في تفاعل التضخيم نفسه. س: أي مزيج بادئات يجب استخدامه: مزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 أم مزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2؟ ج: يُنصح باستخدام مزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 لعينات SARS-CoV-2 المعروفة أو المتوقعة. س: هل يمكن استخدام بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 لتضخيم عينات SARS-CoV-2 غير المتحورة؟ ج: نعم، يمكن استخدامها أيضًا لتضخيم عينات SARS-CoV-2 غير المتحورة. س: ما هي متحورات فيروس SARS-CoV-2 التي تغطيها بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2؟ ج: صُممت بادئات VarSkip Short SARS-CoV-2 القصيرة لتكون مقاومة للمتحورات. وقد تأكدنا من أن هذه البادئات توفر تغطية جينومية عالية للمتحورات التالية: B.1.351 (بيتا)، P.1. (جاما)، B1.617.1 (كابا)، B.1.617.2 (دلتا)، B.1.617.3، BA.1 (أوميكرون)، BA.2 (أوميكرون). س: هل يمكن إضافة أزواج بادئات التحكم البشري NEBNext ARTIC ومزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 إلى نفس تفاعل التضخيم المستهدف؟ ج: نعم، زوجا بادئات التحكم البشري NEBNext ARTIC 1 و2 هما ضوابط داخلية اختيارية. في حال استخدامها، يجب دمج أزواج بادئات التحكم البشري NEBNext ARTIC المناسبة مع مزيج بادئات NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 قبل الاستخدام. يمكن دمج زوج بادئات التحكم البشري 1 مع مزيج بادئات NEBNext ARTIC VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 1، ويمكن دمج زوج بادئات التحكم البشري 2 مع مزيج بادئات NEBNext ARTIC VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 2. تُنتج أزواج بادئات التحكم البشري NEBNext ARTIC قطعًا مضخمة بطول 400 زوج قاعدي، بينما يبلغ طول قطع VarSkip Short v2 المضخمة حوالي 550 زوج قاعدي. بعد التجزئة الأنزيمية، يبلغ حجم قطع التحكم البشري وقطع VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 حوالي 120 زوج قاعدي. سؤال: كيف يمكنني تحليل بيانات تسلسل VarSkip Short v2 SARS-CoV-2؟ ج: يمكن تحليل بيانات تسلسل VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 باستخدام نفس أساليب التحليل المستخدمة في تسلسل تضخيم ARTIC المتعدد. جميع ملفات المراجع اللازمة لتعديل مسارات تحليل تسلسل ARTIC لتحليل تسلسل VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 موجودة على الرابط التالي: https://github.com/nebiolabs/VarSkip. س: هل تسلسلات البادئات في مزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 هي نفسها تسلسلات بادئات ARTIC Network V3؟ ج: نعم، التسلسلات متطابقة، ويمكن الاطلاع عليها هنا. تم موازنة البادئات في مزيج بادئات NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 باستخدام منهجية طُوّرت في NEB استنادًا إلى بيانات تجريبية من التسلسل، وذلك لتحقيق تغطية أكثر تجانسًا عبر الجينوم. س: ما هي قيم العتبة (Ct) الموصى بها للمدخلات المستخدمة مع مجموعة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (من شركة Oxford Nanopore Technologies)؟ ج: وفقًا لإرشادات شبكة ARTIC، يجب أن تتراوح قيمة العتبة (Ct) لمدخل الحمض النووي الريبي الفيروسي من العينات السريرية بين 18 و35. إذا كانت قيمة العتبة (Ct) بين 12 و15، يُوصى بتخفيف العينة 100 ضعف بالماء. أما إذا كانت قيمة العتبة (Ct) بين 15 و18، فيُوصى بتخفيفها 10 أضعاف بالماء. سيقلل هذا من احتمالية تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). س: إذا كنت أستخدم 96 عينة، فهل يمكنني تخطي خطوة التنظيف بعد تضخيم الحمض النووي التكميلي المستهدف؟ ج: بالنسبة للأعداد الكبيرة من العينات، يمكن تخطي خطوة التنظيف بعد تضخيم الحمض النووي التكميلي المستهدف (القسم 2.5 في الدليل) ويمكن استخدام عينات الحمض النووي التكميلي مباشرةً في NEBNext End Prep (القسم 4.1). يتوافق هذا مع بروتوكول تسلسل ARTIC Network nCoV-2019 الإصدار 3 (LoCost). س: ما حجم البيانات المطلوبة عند تسلسل المكتبات المُنشأة باستخدام مجموعة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies)؟ ج: في الاختبارات التي أُجريت باستخدام عينات من الحمض النووي الريبي الاصطناعي أو المُعطَّل حراريًا لفيروس SARS-CoV-2 مع قيمة Ct 30 أو ما يقارب 1000 نسخة من الحمض النووي الريبي الموجه (gRNA)، تم تحقيق تجميع كامل للجينوم (أكثر من 90% للحمض النووي الريبي الاصطناعي وأكثر من 99% للحمض النووي الريبي المُعطَّل حراريًا لفيروس كوفيد-19) باستخدام بيانات تغطية 250x أو 24500 قراءة. س: كيف يُمكنني تحليل بياناتي من مكتبات التسلسل المُنشأة باستخدام مجموعة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies)؟ ج: يُوصى باستخدام ARTIC-nCoV-bioinformaticsSOP-v1.1. من شبكة ARTIC. يمكن استخدام سير عمل RAMPART أيضًا لتعيين القراءات في الوقت الفعلي، ورسم الخرائط، والتحليل التطوري. س: ما هي مجموعات الأدوات التي أحتاجها من Oxford Nanopore Technologies لإتمام سير العمل؟ ج: ستحتاج إلى المجموعات التالية: مجموعة تسلسل الربط من أوكسفورد نانوبور تكنولوجيز (SQK-LSK109) أو مجموعة توسيع مزيج المحولات II من أوكسفورد نانوبور تكنولوجيز (EXP-AMII001)، ومجموعة تحضير خلية التدفق (EXP-FLP002) وقوارير التسلسل المساعدة (EXP-AUX001)، ومجموعة توسيع SFB من أوكسفورد نانوبور تكنولوجيز (EXP-SFB001)، ومجموعات توسيع الترميز الشريطي الأصلي من أوكسفورد نانوبور تكنولوجيز من 1 إلى 12 (EXP-NBD104)، أو من 13 إلى 24 (EXP-NBD114)، أو من 1 إلى 96 (EXP-NBD196). س: هل مجموعة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (من أوكسفورد نانوبور تكنولوجيز) متوافقة مع بروتوكول تسلسل ARTIC Network nCoV-2019 الإصدار 3 (LoCost) أو بروتوكول Eco PCR Tiling من أوكسفورد نانوبور تكنولوجيز؟ ج: هذه المجموعة متوافقة بشكل عام مع هذه البروتوكولات. مع ذلك، من الضروري اتباع بروتوكول NEBNext ARTIC RT-PCR لتحقيق تضخيم مثالي للأمبليكون باستخدام مجموعة البادئات المتوازنة. يُرجى ملاحظة أنه سيلزم شراء مزيج Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix إضافي (NEB #M0494) في حال اتباع هذه البروتوكولات. س: هل هناك نصائح لتجنب التلوث المتبادل للباركود؟ ج: لتجنب التلوث المتبادل للباركود أو عدم تطابقه أثناء تحديد القواعد، يُنصح بإعادة تشغيل برنامج guppy لفرز القراءات التي تم ربط طرفيها 5′ و3′ بنفس الباركود. توفر شركة Oxford Nanopore Technologies معلومات إضافية حول استخدام برنامج guppy مع خيار تحديد القواعد للقراءات ذات الباركود المزدوج. س: هل مجموعة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies) متوافقة مع جميع أجهزة ONT؟ ج: يمكن تشغيل المكتبات المُنشأة باستخدام هذه المجموعة على أي منصة من منصات Oxford Nanopore Technologies. يُوصى باستخدام جهازي MinION وGridION لهذا التطبيق. س: هل تحتوي مجموعة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (من شركة Oxford Nanopore Technologies) على كمية كافية من الخرزات لإتمام عملية تحضير مكتبة ARTIC بالكامل؟ ج: تحتوي المجموعة E7660 على كمية كافية من الخرزات لإتمام عملية التحضير بالكامل، بما في ذلك الأجزاء التي تستخدم مجموعات من شركة Oxford Nanopore Technologies. الكاشف الوحيد المطلوب غير المُضمّن في المجموعة هو الإيثانول بتركيز 80%. س: هل هناك خطوات يُمكنني اتخاذها إذا كان عدد المسامات المُستخدمة منخفضًا عند إجراء التسلسل؟ ج: قد تكون الطرق التالية مفيدة: لضمان عدد جيد من المسامات، يجب تحميل 20 نانوغرام من الحمض النووي للمكتبة للتسلسل على جهازي MinION وGridION. قد تؤثر بعض الملوثات المتبقية من عينات الحمض النووي الريبوزي المُستخلص أو كواشف تحضير المكتبة سلبًا على عدد المسامات. لحل هذه المشكلة، يمكن إجراء غسلتين من الإيثانول بتركيز 80%، كل منهما بحجم 1 مل، في الخطوة 1.6.19 بدلاً من غسلة واحدة بحجم 500 ميكرولتر من الإيثانول بتركيز 80%. كما يمكن تحضير مكتبة DNA أنقى بإجراء غسلة إضافية بحجم 250 ميكرولتر من محلول SFB في الخطوة 1.8.8، ليصبح المجموع ثلاث غسلات بحجم 250 ميكرولتر من محلول SFB. س: هل يمكنني استخدام كمية أقل من محول الباركود الأصلي خلال خطوة الربط (1.5.1)؟ ج: إذا كنت تخطط لتشغيل عدد كبير من العينات، مثلاً 48 عينة لكل عملية تسلسل، يمكنك تقليل حجم التفاعل في الخطوة 1.5.1 إلى النصف، وكذلك تقليل حجم كل مكون في هذا التفاعل إلى النصف. أما إذا كنت تشغل 24 عينة أو أقل، فننصح باتباع بروتوكولنا القياسي. س: كيف يمكن زيادة نسبة القراءات ذات الترميز المزدوج؟ ج: القراءات ذات الترميز المزدوج هي قراءات تحتوي على محول التسلسل في كلا الطرفين. لزيادة نسبة هذه القراءات، يمكن تخفيف نواتج تضخيم RT-PCR بمقدار 3 أضعاف، واستخدام 1 ميكرولتر من النواتج المخففة في خطوة 1.4.1 من برنامج NEBNext End Prep. سيؤدي ذلك إلى تقليل كمية الحمض النووي المدخل ومعدل نقل البيانات النهائي لكل عينة، ولكنه سيحسن كفاءة End Prep وينتج عنه نسبة أعلى من القراءات ذات الترميز المزدوج. نوصي بإجراء هذا التخفيف عند استخدام 48 عينة أو أكثر. س: ماذا لو لم يكن لدي عدد كافٍ من العينات لتوليد كمية كافية من الحمض النووي للمكتبة اللازمة للتسلسل؟ ج: يمكن إجراء تفاعلين أو أكثر من تفاعلات الترميز (الخطوة 1.4.1) لكل عينة تضخيم. نوصي باستخدام نفس الترميز إذا كانت التفاعلات من نفس العينة، لتسهيل تحليل البيانات لاحقًا. س: كيف يمكن زيادة إنتاجية البيانات لعينات ذات قيمة Ct عالية؟ ج: قد تزداد حالات فشل التسلسل في العينات ذات قيمة Ct 30 أو أعلى. في هذه الحالة، يمكن إجراء تفاعلين أو أكثر من تفاعلات الترميز الشريطي (الخطوة 1.4.1) لكل مُضخَّم PCR لزيادة إنتاجية البيانات. نوصي باستخدام نفس الرمز الشريطي إذا كانت التفاعلات من نفس العينة، لتسهيل تحليل البيانات لاحقًا. س: هل يجب أن تكون عينة الحمض النووي الريبوزي الكلي خالية من الحمض النووي قبل بدء سير عمل ARTIC؟ ج: لا، لا يشترط أن يكون الحمض النووي الريبوزي خاليًا من الحمض النووي لسير عمل ARTIC. س: هل مجموعة NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies®) E7660 متوافقة مع مجموعة Oxford Nanopore Native Barcoding Kit V14 (SQK-NBD114)؟ ج: نعم، إنها متوافقة. نوصي باتباع بروتوكول مجموعة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies) E7660 كما في السابق، وليس بروتوكول SQK-NBD114، بما في ذلك تركيز التحميل. س: هل يمكن تحسين التغطية للسلالات الحديثة؟ ج: نعم، تم تصميم واختبار بادئات داخلية لمعالجة مناطق التغطية المنخفضة الناتجة عن سلالتي KP وJN. يمكن توفير هذه البادئات مجانًا عند الطلب. يرجى التواصل عبر البريد الإلكتروني info@neb.com. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام التسلسلات أدناه لتصنيع بادئات مخصصة من مزود الأوليغونوكليوتيدات المفضل لديك. يجب استخدام هذه البادئات الداخلية مع بادئات VarSkip Short v2 باتباع البروتوكولات أدناه. تركيز تسلسل البادئات المستهدفة في مزيج VSSv2f Spike-in في 1xPool (ميكرومولار) 1 varskip-0317-1_1_LEFT_ALT3 ATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACG 0.5 1 varskip-0317-1_05_RIGHT_ALT2 GACAATTTCACAAGCACAGGTTGAG 0.5 1 varskip-0317-1_07_LEFT_ALT2 CCTCTAAAAGCCCCAAAAGAAATTATC 0.5 1 varskip-0317-1_09_RIGHT_ALT2 GTTTACTTTCAGTTATAAATGGCTTAACTTC 0.5 1 varskip-0317-1_11_LEFT_ALT2 GTGGCACTACTGAAATGCTAGC 0.5 1 varskip-0317-1_13_RIGHT_ALT2 TTCATAAGAAAGTGTGCCCATGTAC 0.5 1 varskip-0317-1_15_RIGHT_ALT1 GCTCCAAAGACAACGTATACACC 0.5 1 varskip-0317-1_35_LEFT_ALT2 GATGATTATTTCAATAAAAAGGACTGGTATG 0.5 1 varskip-0317-1_45_RIGHT_ALT2 ATTGATCTCCAGGCGGTGGTTT 0.5 1 49_R_ALT2 GTAATAAGAACACCATTACGGGCAT 0.5 1 varskip-0317-1_53_RIGHT_ALT2 TGAGGATCTGAAAACTTTGTCAGG 0.5 1 55_L_ALT1 CCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTT 0.5 1 varskip-0317-1_57_LEFT_ALT6 CTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGA 0.5 2 varskip-0317-1_24_LEFT_ALT2 GCCTTTAATACTTTACTATTCCTTATGTC 0.5 2 varskip-0317-1_28_RIGHT_ALT2 AGGCCAAAGTAACAAGTACAAAAATAGC 0.5 2 varskip-0317-1_32_RIGHT_ALT2 CTGTTATTGCCTGACCAGTACC 0.5 2 varskip-0317-1_34_RIGHT_ALT2 ATCACAGAATTGTACTGTTTTTAACAAAGC 0.5 2 varskip-0317-1_54_RIGHT_ALT2 CTTCAAGGTCCATAAGAAAAGGCT 0.5 2 56L_ALT1 TTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGG 0.5 2 varskip-0317-1_56_RIGHT_ALT2 CAGCCTGTAAAATCATCTGGTAATTTAT 0.5 بروتوكولات استخدام البادئات المُضافة: بالنسبة لمجموعات 96 تفاعلًا: قم بإذابة مزيج البادئات المُضافة VSSv2f 1، ومزيج البادئات المُضافة VSSv2f 2، ومزيج البادئات VSSv2 1، ومزيج البادئات VSSv2 2. اخلط جميع الأنابيب الأربعة وقم بتدويرها بسرعة. أضف 3 ميكرولتر من مزيج البادئات المُضافة VSSv2f 1 إلى مزيج البادئات VSSv2 1، وقم بالخلط باستخدام جهاز الخلط الدوامي، ثم قم بالتدوير، وضع المزيج على الثلج. أضف 2.5 ميكرولتر من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 2 إلى مزيج VSSv2 Primer Mix 2، ثم رجّ المزيج جيدًا، ثم قم بالطرد المركزي، وضع المزيج على الثلج. استخدم مزيج VarSkip Short v2 Primer Mix 1 و2 المُدعّمين لبروتوكول RT-PCR. بالنسبة لمجموعات 24 تفاعلًا: قم بإذابة مزيج VSSv2f Spike-in Mix 1، ومزيج VSSv2f Spike-in Mix 2، ومزيج VSSv2 Primer Mix 1، ومزيج VSSv2 Primer Mix 2. امزج جميع الأنابيب الأربعة وقم بالطرد المركزي السريع. أضف 2 ميكرولتر من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 1 إلى 2 ميكرولتر من محلول TE بتركيز 0.1x لتحضير تخفيف ½ من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 1. أضف 1.5 ميكرولتر من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 1 المخفف إلى مزيج VSSv2 Primer Mix 1، ثم رجّ المزيج جيدًا، ثم قم بالطرد المركزي، وضع المزيج على الثلج. أضف 2 ميكرولتر من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 2 إلى 2 ميكرولتر من محلول TE بتركيز 0.1x لتحضير تخفيف ½ من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 2. أضف 1.25 ميكرولتر من مزيج VSSv2f Spike-in Mix 2 المخفف إلى مزيج VSSv2 Primer Mix 2، ثم اخلط المزيج جيدًا، وقم بتدويره، وضعه على الثلج. استخدم مزيج VarSkip Short v2 Primer Mix 1 و2 المُضاف إليهما في بروتوكول RT-PCR.