نيو إنجلاند بيولابس، E7750S، مجموعة استنفاد الغلوبين والحمض النووي الريبوزي NEBNext® (بشري/فأر/جرذ)

يُعدّ كلٌّ من mRNA و rRNA الخاص بالغلوبين وفيرًا جدًا في عينات الدم، ويُستحسن إزالتهما بكفاءة ودقة للكشف عن الأهمية البيولوجية للنسخ الأقل وفرة. الفئات ذات الصلة: استنزاف الحمض النووي الريبوزي وإثراء mRNA، تحليل ما فوق النسخ، تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي لتقنية Illumina. المواد المطلوبة (غير مُرفقة ): حامل مغناطيسي مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext (NEB #S1515)، إيثانول 80% (مُحضّر حديثًا)، جهاز تدوير حراري، أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) رقيقة الجدران سعة 200 ميكرولتر، جهاز Bioanalyzer® أو TapeStation® (Agilent Technologies, Inc.) أو محلل شظايا مماثل ومواد استهلاكية، خرز Agencourt® RNAClean® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63987). الأسئلة الشائعة : س: ما هي الأنواع التي يُمكنني استخدام مجموعة استنزاف mRNA و rRNA الخاصة بالغلوبين من NEBNext® معها؟ هل ستعمل مع أنواع أخرى؟ ج: تعمل هذه المجموعة على استنفاد الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والريبوزومي (rRNA) للغلوبين من الحمض النووي الريبوزي الكلي للإنسان والفأر والجرذ. ويمكن استخدامها في أنواع أخرى إذا كانت تسلسلات الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والريبوزومي (rRNA) للغلوبين مشابهة لتلك الموجودة في الإنسان والفأر والجرذ. س: ما هي أنواع الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والريبوزومي (rRNA) للغلوبين التي يتم استنفادها باستخدام مجموعة NEBNext® لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والريبوزومي (rRNA) للغلوبين (الإنسان/الفأر/الجرذ)؟ ج: تعمل هذه المجموعة على استنفاد الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) للغلوبين لدى البالغين والجنين والخلايا الجنينية (HBA 1/2، HBB، HBD، HBM، HBG1/2، HBE، HBQ1، وHBZ). كما يتم استنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوومي (rRNA) السيتوبلازمي (5S، 5.8S، 18S، 28S، ITS، وETS) والميتوكوندريا (12S و16S). س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext® لاستنفاد mRNA و rRNA للغلوبين (بشري/فأر/جرذ) مع الحمض النووي الريبوزي المتدهور أو المجزأ؟ ج: نعم، يمكن استخدام هذه المجموعة مع الحمض النووي الريبوزي المتدهور أو المجزأ. س: ما هي كمية الحمض النووي الريبوزي الكلية التي يجب استخدامها؟ ج: تم تحسين المجموعة لاستخدام كمية إجمالية من الحمض النووي الريبوزي تتراوح بين 10 و1000 نانوغرام (100 نانوغرام كحد أدنى للحمض النووي الريبوزي المجزأ أو المتدهور). بالنسبة لتسلسل الحمض النووي الريبوزي، نوصي باستخدام كميات أكبر من 100 نانوغرام لزيادة تعقيد المكتبة وتقليل معدل التكرار. س: لماذا يجب أن يكون الحمض النووي الريبوزي خاليًا من الحمض النووي؟ ج: يمكن أن يتسبب الحمض النووي الملوث في عدم دقة قياس كمية الحمض النووي الريبوزي ويعيق الإزالة الصحيحة لـ mRNA و rRNA للغلوبين. س: ما هو ناتج الحمض النووي الريبوزي المتوقع استعادته بعد استنفاد mRNA و rRNA للغلوبين؟ ج: تختلف نسبة الحمض النووي الريبوزي المعزول بعد استنفاد mRNA و rRNA للغلوبين باختلاف عينات الحمض النووي الريبوزي. عادةً، يتم استرداد 1-3% من الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُدخل. س: ما هي نسبة الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) للغلوبين المتبقية بعد الاستنفاد؟ ج: تختلف نسبة الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) للغلوبين المتبقية بعد الاستنفاد باختلاف الأنواع. عادةً، يتبقى أقل من 1% من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) للغلوبين، وما بين 1% (في الإنسان) و5% (في الفأر/الجرذ) من الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA). س: كيف يمكنني تحديد ما إذا كان استنفاد الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) للغلوبين فعالاً؟ ج: لتقييم كفاءة الاستنفاد، صمم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) للغلوبين في عينة النوع، وبادئات لجين مرجعي. قارن محتوى الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) للغلوبين قبل الاستنفاد وبعده. س: أنا مهتم فقط بالحمض النووي الريبوزي المشفر. هل يمكنني استخدام مجموعة استنفاد الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) للغلوبين من NEBNext® (الإنسان/الفأر/الجرذ) لإزالة الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) للغلوبين من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المُخصب مسبقًا؟ ج: نعم. يمكن استخدام هذه المجموعة بعد إثراء mRNA متعدد الأدينين (على سبيل المثال، باستخدام وحدة العزل المغناطيسي NEBNext Poly(A) mRNA، NEB #E7490)، بحيث يحتوي الحمض النووي الريبوزي النهائي المُستنفد على mRNA المطلوب فقط، وليس على الحمض النووي الريبوزي غير المشفر. س: هل تعمل مجموعة استنفاد mRNA و rRNA للغلوبين من NEBNext® (البشري/الفأري/الجرذي) في تطبيقات البصمة الريبوزومية أو التنميط؟ ج: لم يتم التحقق من صحة البروتوكول المُرفق بهذه المجموعة لتطبيقات البصمة الريبوزومية أو التنميط. س: هل يمكنني استخدام خرز Agencourt® AMPure® XP المغناطيسي بدلاً من خرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي NEBNext® (خرز RNAClean® XP المغناطيسي)؟ ج: نعم، من الممكن استخدام خرز AMPure XP. مع ذلك، نوصي باستخدام خرز RNAClean XP / خرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي NEBNext® (المرفقة في عبوة NEB رقم E7755) حيث تم تصنيع هذه الخرزات واختبارها لإزالة تلوث RNase. تتضمن إحدى نسخ المجموعة هذه الخرزات: مجموعة NEBNext® لاستنفاد mRNA و rRNA للغلوبين (بشري/فأر/جرذ) مع خرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي (NEB رقم E7755). سؤال: هل يمكنني استخدام طرق تنقية أخرى غير خرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي NEBNext® / خرز Agencourt® RNAClean® XP المغناطيسي؟ ج: على الرغم من أننا نوصي باستخدام خرز RNAClean® XP لتنقية عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) من NEBNext® (المرفقة في عبوة NEB رقم E7755)، إلا أنه يمكن تنقية العينات المستنفدة من الحمض النووي الريبوزي (rRNA) عن طريق الترسيب بالإيثانول أو باستخدام أدوات تنظيف أعمدة الحمض النووي الريبوزي مثل مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (NEB رقم T2030). للاستخدام مع أعمدة أخرى، يُرجى مراجعة مواصفات العمود لمعرفة نطاق حجم الحمض النووي الريبوزي (RNA) لضمان الاحتفاظ بأي حمض نووي ريبوزي مجزأ أثناء عملية التنظيف. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي المُخصب الناتج عن مجموعة استنفاد NEBNext في تطبيقات تسلسل القراءة الطويلة؟ ج: نعم، ولكن تجدر الإشارة إلى أن الحمض النووي الريبوزي (RNA) يتعرض لبعض التجزئة أثناء عملية الاستنفاد، مما قد يُقلل من طول القراءة. س: هل يُمكنني استخدام مجموعة NEBNext UltraExpress® لتحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA Library Prep Kit) مع مجموعة NEBNext® لاستنفاد الغلوبين والحمض النووي الريبوزي (rRNA Depletion Kit) (للبشر/الفأر/الجرذ) أو مجموعة NEBNext® RNA Depletion Core Reagent Set؟ ج: من الممكن استخدام مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي NEBNext UltraExpress مع مجموعة استنفاد الغلوبين والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي NEBNext (للبشر/الفأر/الجرذ) أو مجموعة كواشف استنفاد الحمض النووي الريبوزي الأساسية NEBNext، ولكن لا يوجد بروتوكول رسمي. يُرجى التواصل مع الدعم الفني لشركة NEB عبر البريد الإلكتروني info@neb.com للحصول على التعليمات.