نيو إنجلاند بيولابس، E7760L، مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext® Ultra™ II لـ Illumina®

للاستخدام مع هذه المجموعة، وحدة العزل المغناطيسي لـ mRNA متعدد الأدينين NEBNext ( الفئات ذات الصلة: أتمتة تحضير مكتبة NEGS من NEBNext®، تحضير مكتبة RNA لـ Illumina، تطبيقات تحضير مكتبة تسلسل الجيل التالي، تطبيقات إنزيمات USER® و USER II الحرارية، المواصفات ، المواد المطلوبة ولكن غير المرفقة: قليل النوكليوتيدات أحادي أو متعدد NEBNext لـ Illumina (NEB.com/oligos) أو قليل النوكليوتيدات الذي يوفره العميل، حامل أو صفيحة مغناطيسية (مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext® (NEB #S1515S)، صفيحة Alpaqua® 96S المغناطيسية الفائقة (#A001322)، أو ما يعادلها)، مجموعة كواشف SPRIselect® (Beckman Coulter, Inc. #B23317) أو خرز AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881)، إيثانول 80% (مُحضر حديثًا)، حراري وحدة عزل mRNA متعدد الأدينين المغناطيسية NEBNext (NEB #E7490) أو مجموعة استنفاد rRNA الإصدار الثاني NEBNext® (بشري/فأري/جرذي) (NEB #E7400 أو NEB #E7405) أو مجموعة استنفاد الغلوبين وrRNA NEBNext® (بشري/فأري/جرذي) (NEB #E7750 أو NEB #E7755) أو مجموعة استنفاد rRNA NEBNext® (بكتيريا) (NEB #E7850 أو NEB #E7860) أو مجموعة كواشف استنفاد RNA الأساسية NEBNext® (NEB #E7865 أو NEB #E7870) أو مجموعة استنفاد rRNA NEBNext (بشري/فأري/جرذي) (NEB #E6310 أو NEB #E6350) الأسئلة الشائعة : س: لدي إنزيم USER من مجموعة تحضير المكتبة الخاصة بي س: هل إنزيم USER ذو الغطاء الأزرق (من مجموعة NEBNext Index Primer) (ذو الغطاء الأحمر) هو نفسه إنزيم USER الموجود في مجموعة NEBNext Ultra RNA Directional؟ ج: نعم، هو نفسه. نوفر إنزيم USER في مجموعات NEBNext Ultra RNA Directional لأنه ضروري لسير العمل (ذو الغطاء الأزرق). أما إنزيم USER ذو الغطاء الأحمر، فيُوفر في مجموعات الأوليغومرات الخاصة بنا لاستخدامه مع محول NEBNext. إذا كنت تستخدم مجموعة NEBNext Ultra I أو Ultra II Directional RNA Library prep مع محول NEBNext، فستحتاج إلى خطوة USER واحدة فقط، ويمكنك استخدام أي من قارورتي إنزيم USER المرفقتين. س: ما الفرق بين مجموعة NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep (NEB #E7760) ومجموعة NEBNext Ultra II RNA Library Prep (NEB #E7770)؟ ج: يحافظ سير عمل NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep على معلومات اتجاه سلسلة الحمض النووي الريبوزي (RNA)، بينما لا يفعل ذلك سير عمل NEBNext Ultra II RNA Library Prep. تحتوي مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext Ultra II على dUTP في محلول تخليق السلسلة الثانية، مما يسمح بوسم الحمض النووي التكميلي (cDNA) للسلسلة الثانية واستئصاله لاحقًا باستخدام إنزيم USER. كما تحتوي أيضًا على كاشف تحديد السلسلة لتحسين الاتجاهية. س: ما الفرق بين مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext Ultra II (NEB #E7760) ومجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext Ultra الأصلية (NEB #E7420)؟ ج: تم تحسين كل خطوة في سير عمل مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext Ultra II، بما في ذلك إضافة العديد من الكواشف الجديدة. يتيح ذلك استخدام كميات مدخلات أقل بمقدار 10 إلى 20 ضعفًا وعدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أقل مقارنةً بالمجموعة الأصلية، مما ينتج عنه غلة مكتبة أعلى بكثير، دون المساس بجودتها. كما تم تضمين كاشف تحديد السلسلة. س: ما هي البداية س: ما هي المواد التي أحتاجها عند تحضير المكتبات باستخدام مجموعة NEBNext Ultra II Directional RNA؟ ج: المادة الأولية هي الحمض النووي الريبوزي الكلي (10 نانوغرام - 1 ميكروغرام)؛ أو الحمض النووي الريبوزي الرسول المعزول مسبقًا (1-100 نانوغرام) أو الحمض النووي الريبوزي المستنفد من الريبوسومات (1-100 نانوغرام). س: ما هي المجموعة التي يمكنني استخدامها لعزل الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين من الحمض النووي الريبوزي الكلي؟ ج: لعزل الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين من الحمض النووي الريبوزي الكلي، استخدم وحدة العزل المغناطيسي للحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين من NEBNext (NEB #E7490). س: ما هي المجموعة التي يمكنني استخدامها لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي من الحمض النووي الريبوزي البشري أو الفأري أو الجرذي؟ ج: لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي من الإنسان أو الفأر أو الجرذ، استخدم مجموعة NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Human/Mouse/Rat) (NEB #7400). س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext هذه مع محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB؟ ج: نعم، من الممكن استخدام محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB مع مجموعة NEBNext هذه. يجب أن يكون المحول من نوع T overhang، وقد يكون مردود المكتبة النهائي أقل قليلاً من استخدام محولات NEBNext الخاصة بـ Illumina®. تتوفر تعليمات الاستخدام مع المحولات غير التابعة لـ NEBNext، كاملة الطول، والمشفرة، وبادئات PCR العالمية P5 وP7 في كتيبات محولات NEBNext المفهرسة/UMI. يمكن العثور على هذه الكتيبات على neb.com/E7416 (RNA) أو neb.com/E7395 (DNA). اختر كتيب مجموعة NEBNext التي ستستخدمها. كُتبت هذه الكتيبات خصيصًا لمحولات NEBNext المفهرسة/UMI، وينبغي أن يعمل البروتوكول نفسه مع محولات أخرى ذات تصميم مشابه. نوصي بإجراء تجربة لإثبات المبدأ باستخدام مجموعة تحضير المكتبة والمحولات المفهرسة المطلوبة، واستخدام عينات قابلة للاستهلاك لتحسين ظروف التجربة. س: ماذا أفعل؟ ماذا أفعل إذا رأيت راسبًا في محلول تفاعل تحضير النهاية Ultra II؟ ج: من الشائع رؤية راسب أبيض في محلول إصلاح النهاية Ultra II. في هذه الحالة، اترك الخليط حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم الماصة لسحب المحلول عدة مرات لتفتيت الراسب، ثم قم برجّه سريعًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. س: هل من الممكن تقليل حجم الخرز المضاف خلال خطوة تنظيف تخليق السلسلة الثانية؟ ج: يبلغ الحجم الإجمالي للعينة عند إضافة الخرز خلال خطوة تنظيف تخليق السلسلة الثانية 224 ميكرولتر، وهو ما قد يتجاوز حجم بعض أنابيب وألواح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) سعة 0.2 مل. بالإضافة إلى ذلك، قد لا يسمح هذا الحجم بفصل الخرز بشكل كامل باستخدام بعض المغناطيسات. تتمتع العديد من ألواح وأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات السعة الاسمية 0.2 مل بسعة فعلية أكبر تستوعب عينة بحجم 224 ميكرولتر. مع ذلك، إذا كان اللوح أو الأنبوب الذي تفضل استخدامه لا يتسع لحجم عينة 224 ميكرولتر، فمن الممكن تقليل حجم الخرز إلى 1.5 × (120 ميكرولتر) ليصبح إجمالي حجم السائل 200 ميكرولتر فقط. لم نلاحظ أي انخفاض في إنتاجية المكتبة النهائية. س: ما هو تركيب البادئات العشوائية؟ ج: البادئات العشوائية عبارة عن سداسيات عشوائية متوفرة بتركيز 1.9 ملي مولار. س: هل تتضمن المجموعة محولًا وبادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع NEBNext Multiplex Oligos for Illumina. للاطلاع على القائمة الكاملة، راجع مخطط اختيار NEBNext® Multiplex Oligos. للاستخدام مع مجموعات تحضير مكتبة NEBNext، راجع دليل مجموعة تحضير المكتبة. تحتوي الأدلة الخاصة بمجموعة multiplex oligo أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات PCR. لخيارات موازنة الألوان، يرجى مراجعة NEBNext® Index Oligo Selector للاطلاع على تركيبات الباركود الصالحة. س: هل من الممكن تقليل حجم الخرز المضاف خلال خطوة تنظيف تخليق السلسلة الثانية من البروتوكول لـ E7760 وE7765 وE7770 و E7775؟ ج: يبلغ الحجم الإجمالي للعينة عند إضافة الخرز خلال خطوة تنقية تخليق السلسلة الثانية 224 ميكرولتر، وهو ما قد يتجاوز حجم بعض أنابيب وألواح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) سعة 0.2 مل. إضافةً إلى ذلك، قد لا يسمح هذا الحجم بفصل الخرز بشكل كامل باستخدام بعض أنواع المغناطيس. تتمتع العديد من ألواح وأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات السعة الاسمية 0.2 مل بسعة فعلية أكبر تستوعب عينة بحجم 224 ميكرولتر. مع ذلك، إذا كان اللوح أو الأنبوب الذي تفضل استخدامه لا يتسع لحجم عينة 224 ميكرولتر، فمن الممكن تقليل حجم الخرز إلى 1.5 × (120 ميكرولتر) ليصبح الحجم الإجمالي للسائل 200 ميكرولتر فقط.