نيو إنجلاند بيولابس، E7765S، NEBNext® Ultra™ II تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الاتجاهي مع خرز تنقية العينات

هل تحتاج إلى حساسية ودقة أعلى في تجارب تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)؟ هل لديك كميات متناقصة باستمرار من الحمض النووي الريبوزي المُدخل؟ لمواجهة هذه التحديات، أُعيدت صياغة الجيل التالي من مجموعات تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي المُخصصة للسلسلة في كل خطوة، مما أدى إلى زيادة إنتاجية المكتبات عالية الجودة عدة أضعاف، وتمكين استخدام كميات أقل من الحمض النووي الريبوزي المُدخل وعدد أقل من دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تستخدم مجموعة Ultra II Directional RNA طريقة "dUTP" (1، 2) لتحديد السلسلة، وتتميز بسير عمل مُبسط وقابل للأتمتة. الفئات ذات الصلة: أتمتة تحضير مكتبة NEBNext® NGS، تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) لـ Illumina، مواصفات تحضير مكتبة تسلسل الجيل التالي. المواد المطلوبة (غير مُرفقة): أوليغومرات NEBNext أحادية أو متعددة لـ Illumina (NEB.com/oligos) أو أوليغومرات مُقدمة من العميل، حامل أو صفيحة مغناطيسية (مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext® (NEB #S1515S)، أو صفيحة Alpaqua® 96S المغناطيسية الفائقة (#A001322)، أو ما يُعادلها)، مجموعة كواشف SPRIselect® (Beckman Coulter, Inc. #B23317) أو خرز AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. #A63881)، إيثانول 80% (مُحضر حديثًا)، جهاز تدوير حراري، وحدة عزل مغناطيسية NEBNext Poly(A) mRNA (NEB #E7490) أو مجموعة استنفاد الحمض النووي الريبوزي (rRNA) NEBNext® الإصدار 2 (بشري/فأري/جرذي) (NEB #E7400 أو NEB #E7405) أو مجموعة استنفاد الغلوبين والحمض النووي الريبوزي NEBNext® (بشري/فأري/جرذي) (NEB #E7750 أو NEB #E7755) أو مجموعة استنفاد الحمض النووي الريبوزي NEBNext® (بكتيريا) (NEB #E7850 أو NEB #E7860) أو مجموعة كواشف استنفاد الحمض النووي الريبوزي الأساسية NEBNext® (NEB #E7865 أو NEB #E7870) أو مجموعة استنفاد الحمض النووي الريبوزي NEBNext (بشري/فأري/جرذي) (NEB #E6310 أو NEB #E6350) الأسئلة الشائعة : س: لديّ إنزيم USER من مجموعة تحضير المكتبة (غطاء أزرق) وإنزيم USER من مجموعة NEBNext Index Primer (غطاء أحمر). هل هما متطابقان؟ ج: نعم، إنهما متطابقان. نُوفّر إنزيم USER في مجموعات NEBNext Ultra RNA Directional لأنه ضروري لسير العمل (الغطاء الأزرق). أما إنزيم USER ذو الغطاء الأحمر، فيُوفّر في مجموعات الأوليغومرات الخاصة بنا لاستخدامه مع محوّل NEBNext. عند استخدام مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext Ultra I أو Ultra II مع محوّل NEBNext، تكفي خطوة واحدة فقط باستخدام إنزيم USER، ويمكن استخدام أيٍّ من قارورتي إنزيم USER المُرفقتين. س: ما الفرق بين تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي NEBNext Ultra II مع خرز تنقية العينة (NEB #E7775) وتحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext Ultra II مع خرز تنقية العينة (NEB #E7765)؟ ج: يحافظ سير عمل تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext Ultra II على معلومات اتجاه سلسلة الحمض النووي الريبوزي، بينما لا يفعل ذلك سير عمل تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext Ultra II. تحتوي مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الاتجاهي NEBNext Ultra II على dUTP في محلول تخليق السلسلة الثانية، مما يسمح بوسم الحمض النووي التكميلي (cDNA) للسلسلة الثانية واستئصاله لاحقًا باستخدام إنزيم USER. س: ما هي المادة الأولية التي أحتاجها عند تحضير المكتبات باستخدام مجموعة NEBNext Ultra II لتحضير الحمض النووي الريبوزي الاتجاهي؟ ج: المادة الأولية هي الحمض النووي الريبوزي الكلي (10 نانوغرام - 1 ميكروغرام)؛ أو الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المعزول مسبقًا (1-100 نانوغرام) أو الحمض النووي الريبوزي المستنفد من الريبوسومات (1-100 نانوغرام). س: ما هي المجموعة التي يمكنني استخدامها لعزل الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين (poly(A)) من الحمض النووي الريبوزي الكلي؟ ج: لعزل الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين من الحمض النووي الريبوزي الكلي، استخدم وحدة العزل المغناطيسي للحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين NEBNext (NEB #E7490). س: ما هي المجموعة التي يمكنني استخدامها لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) من الحمض النووي الريبوزي البشري أو الفأري أو الجرذي؟ ج: لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي (rRNA) من الإنسان أو الفأر أو الجرذ، استخدم مجموعة NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (الإنسان/الفأر/الجرذ) (NEB #7400). س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext هذه مع محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB؟ ج: نعم، من الممكن استخدام محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB مع مجموعة NEBNext هذه. يجب أن يكون المحول من نوع T overhang، وقد يكون ناتج المكتبة النهائي أقل قليلاً من الناتج عند استخدام محولات NEBNext الخاصة بـ Illumina®. تتوفر تعليمات الاستخدام مع محولات غير تابعة لـ NEBNext، كاملة الطول ومُرمّزة، وبادئات P5 وP7 العالمية لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في كتيبات محولات NEBNext المفهرسة/UMI. يمكن العثور على هذه الكتيبات على الموقع الإلكتروني neb.com/E7416 (RNA) أو neb.com/E7395 (DNA). اختر دليل مجموعة NEBNext التي ستستخدمها. كُتبت الأدلة خصيصًا لمحولات NEBNext المفهرسة/UMI، وينبغي أن يعمل البروتوكول نفسه مع محولات أخرى ذات تصميم مشابه. نوصي بإجراء تجربة أولية باستخدام مجموعة تحضير المكتبة المطلوبة والمحولات المفهرسة المطلوبة، واستخدام عينات قابلة للاستهلاك لتحسين ظروف التجربة. س: ماذا أفعل إذا رأيت راسبًا في محلول تفاعل تحضير النهاية Ultra II؟ ج: من الشائع رؤية راسب أبيض في محلول إصلاح النهاية Ultra II. في هذه الحالة، اترك الخليط حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم الماصة عدة مرات لسحب المحلول وسكبه لتفتيت الراسب، ثم قم برجّه سريعًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. س: هل من الممكن تقليل حجم الخرز المضاف خلال خطوة تنظيف تخليق السلسلة الثانية؟ ج: يبلغ الحجم الإجمالي للعينة عند إضافة الخرز خلال خطوة تنظيف تخليق السلسلة الثانية 224 ميكرولتر، وهو ما قد يتجاوز حجم بعض أنابيب وألواح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) سعة 0.2 مل. بالإضافة إلى ذلك، قد لا يسمح هذا الحجم بفصل الخرزات تمامًا باستخدام بعض المغناطيسات. تتمتع العديد من صفائح وأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات السعة الاسمية 0.2 مل بسعة فعلية أكبر تستوعب عينة بحجم 224 ميكرولتر. مع ذلك، إذا كانت الصفيحة أو الأنبوب الذي تفضل استخدامه لا يتسع لحجم عينة 224 ميكرولتر، فمن الممكن تقليل حجم الخرزات إلى 1.5 × (120 ميكرولتر) ليصبح إجمالي حجم السائل 200 ميكرولتر فقط. لم نلاحظ أي انخفاض في إنتاجية المكتبة النهائية. س: ما هو تركيب البادئات العشوائية؟ ج: البادئات العشوائية عبارة عن سداسيات عشوائية متوفرة بتركيز 1.9 ملي مولار. س: هل تتضمن المجموعة محولًا وبادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع NEBNext Multiplex Oligos for Illumina. للاطلاع على القائمة الكاملة، راجع مخطط اختيار NEBNext® Multiplex Oligos. للاستخدام مع مجموعات تحضير مكتبات NEBNext، يُرجى الرجوع إلى دليل مجموعة تحضير المكتبات. تحتوي الأدلة الخاصة بمجموعة الأوليغونوكليوتيدات المتعددة أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات PCR. للاطلاع على خيارات موازنة الألوان، يُرجى مراجعة مُحدد فهرس الأوليغونوكليوتيدات NEBNext® للاطلاع على تركيبات الباركود الصالحة.