نيو إنجلاند بيولابس، E7770S، مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي NEBNext® Ultra™ II لتقنية Illumina®

هل تفضل استخدام طرق تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي غير الموجهة، ولكنك تحتاج إلى حساسية ودقة أعلى في تجارب تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)، مع كميات متناقصة باستمرار من الحمض النووي الريبوزي المدخل؟ لمعالجة هذه التحديات، تمت إعادة صياغة الجيل التالي من مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي غير الموجهة في كل خطوة، مما أدى إلى زيادة إنتاجية المكتبات عالية الجودة عدة أضعاف، وتمكين استخدام كميات أقل من الحمض النووي الريبوزي المدخل وعدد أقل من دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الفئات ذات الصلة: تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) لتقنية Illumina. المواصفات: المواد المطلوبة (غير متوفرة): أوليغومرات NEBNext أحادية أو متعددة لتقنية Illumina (NEB.com/oligos) أو أوليغومرات يوفرها العميل. حامل أو صفيحة مغناطيسية (مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext® (NEB #S1515S)، أو صفيحة Alpaqua® 96S المغناطيسية الفائقة (#A001322)، أو ما يعادلها). إيثانول 80% (مُحضر حديثًا). جهاز التدوير الحراري. وحدة العزل المغناطيسي للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) متعدد الأدينين NEBNext (NEB #E7490) أو مجموعة استنزاف الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) الإصدار 2 (بشري/فأري/جرذي) NEBNext (NEB #E7400 أو NEB #E7405) أو مجموعة استنزاف الغلوبين والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (بشري/فأري/جرذي) NEBNext (NEB #E7750 أو NEB #E7755) أو NEBNext® مجموعة استنفاد الحمض النووي الريبوزي (للبكتيريا) (NEB #E7850 أو NEB #E7860) أو مجموعة كواشف استنفاد الحمض النووي الريبوزي الأساسية NEBNext® (NEB #E7865 أو NEB #E7870) أو مجموعة استنفاد الحمض النووي الريبوزي NEBNext (للبشر/الفأر/الجرذ) (NEB #E6310 أو NEB #E6350) الأسئلة الشائعة : س: هل تتضمن المجموعة محولًا وبادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع NEBNext Multiplex Oligos لـ Illumina. للاطلاع على القائمة الكاملة، راجع مخطط اختيار NEBNext® Multiplex Oligos. للاستخدام مع مجموعات تحضير مكتبات NEBNext، راجع دليل مجموعة تحضير المكتبات. تحتوي الأدلة الخاصة بمجموعة multiplex oligo أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات PCR. لخيارات موازنة الألوان، يرجى مراجعة NEBNext® Index Oligo Selector للاطلاع على تركيبات الباركود الصالحة. س: هل مجموعة Monarch® Total RNA Miniprep Kit متوافقة مع كواشف NEBNext® لتحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي المُنقّى بهذه المجموعة لتحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي باستخدام كواشف NEBNext RNA Library Prep من NEB. كما يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي المُنقّى بواسطة Monarch لتحضير مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبوزي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني. تتم مقارنة مستويات النسخ في الحمض النووي الريبوزي المرجعي البشري العالمي (UHRR، Agilent) قبل وبعد إعادة التنقية باستخدام إما Qiagen RNeasy® أو مجموعة Monarch Total RNA Miniprep Kit. لوحظ ارتباط قوي مع UHRR غير المعالج لكلا الطريقتين (معامل ارتباط بيرسون R > 0.99 لكلا العينتين). تُظهر جميع العينات تغطية متسقة من البداية إلى النهاية للنسخ، مما يشير إلى عدم وجود تحلل ملحوظ أثناء التنقية. تم استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنتقى بتقنية Poly-A من 100 نانوغرام من عينات غير مُعالجة، وعينات Qiagen، وعينات Monarch باستخدام وحدة العزل المغناطيسي للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) بتقنية Poly-A من NEBNext (NEB #E7490). ثم تم تحضير مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) باستخدام مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الاتجاهية NEBNext Ultra II لـ Illumina® (NEB #E7760) قبل التسلسل على جهاز Miseq® (2 × 150). تم أخذ عينات عشوائية من 1.6 مليون قراءة من كل مكتبة، وتم تقليمها باستخدام برنامج Seqprep v1.1. تم تقييم مستويات جميع نسخ Gencode v26 باستخدام برنامج Salmon (0.4) ورُسمت أعلاه (اللوحة أ). يُظهر الشكل أدناه (اللوحة ب) متوسط ​​تغطية النسخ الجينية Gencode v26 في الاتجاه 5'-3' (تم تقييمها بواسطة برنامج Picard's CollectRnaSeqMetrics 1.56 بعد ربطها بالجينوم المرجعي GRCh38 باستخدام Hisat v2.0.3 وتحديد النسخ المكررة باستخدام برنامج Picard's MarkDuplicates 1.56). س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext هذه مع محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB؟ ج: نعم، من الممكن استخدام محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB مع مجموعة NEBNext هذه. يجب أن يكون المحول من نوع T overhang، وقد يكون ناتج المكتبة النهائي أقل قليلاً من الناتج عند استخدام محولات NEBNext الخاصة بـ Illumina®. يمكن الاطلاع على تعليمات الاستخدام مع المحولات غير التابعة لـ NEBNext، والمشفرة بالكامل، وبادئات P5 وP7 العالمية لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في أدلة محولات NEBNext المفهرسة/UMI. يمكنك العثور على هذه الأدلة على الموقع الإلكتروني neb.com/E7416 (RNA) أو neb.com/E7395 (DNA). اختر دليل مجموعة NEBNext التي ستستخدمها. كُتبت هذه الأدلة خصيصًا لمحولات NEBNext المفهرسة/UMI، وينبغي أن يعمل البروتوكول نفسه مع محولات أخرى ذات تصميم مشابه. نوصي بإجراء تجربة أولية باستخدام مجموعة تحضير المكتبة المطلوبة والمحولات المفهرسة المطلوبة، واستخدام عينات قابلة للاستهلاك لتحسين ظروف التجربة. س: ما هي المجموعة التي يمكنني استخدامها لعزل mRNA متعدد الأدينين من الحمض النووي الريبوزي الكلي؟ ج: لعزل mRNA متعدد الأدينين من الحمض النووي الريبوزي الكلي، استخدم وحدة العزل المغناطيسي NEBNext لمرسال mRNA متعدد الأدينين (NEB #E7490). س: هل من الممكن تقليل حجم الخرز المضاف خلال خطوة تنظيف تخليق السلسلة الثانية من بروتوكول E7760 وE7765 وE7770 وE7775؟ ج: يبلغ الحجم الإجمالي للعينة عند إضافة الخرز خلال خطوة تنقية تخليق السلسلة الثانية 224 ميكرولتر، وهو ما قد يتجاوز حجم بعض أنابيب وألواح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) سعة 0.2 مل. إضافةً إلى ذلك، قد لا يسمح هذا الحجم بفصل الخرز بشكل كامل باستخدام بعض أنواع المغناطيس. تتمتع العديد من ألواح وأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات السعة الاسمية 0.2 مل بسعة فعلية أكبر تستوعب عينة بحجم 224 ميكرولتر. مع ذلك، إذا كان اللوح أو الأنبوب الذي تفضل استخدامه لا يتسع لحجم عينة 224 ميكرولتر، فمن الممكن تقليل حجم الخرز إلى 1.5 × (120 ميكرولتر) ليصبح الحجم الإجمالي للسائل 200 ميكرولتر فقط. س: ما هي المادة الأولية التي أحتاجها عند تحضير المكتبات باستخدام مجموعة NEBNext Ultra II Directional RNA؟ ج: المادة الأولية هي الحمض النووي الريبوزي الكلي (10 نانوغرام - 1 ميكروغرام). الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المعزول مسبقًا (1-100 نانوغرام) أو الحمض النووي الريبوزي المستنفد من الريبوسومات (1-100 نانوغرام). س: ما هي المجموعة التي يمكنني استخدامها لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) من الحمض النووي الريبوزي البشري أو الفأري أو الجرذي؟ ج: لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي من الحمض النووي الريبوزي البشري أو الفأري أو الجرذي، استخدم مجموعة NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (البشري/الفأري/الجرذي) (NEB #7400). س: ما الفرق بين مجموعة NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit (NEB #E7770) ومجموعة NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit الأصلية (NEB #E7530)؟ ج: تم تحسين كل خطوة في سير عمل مجموعة NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit، بما في ذلك دمج العديد من الكواشف الجديدة. يُمكّن هذا من استخدام كميات مدخلات أقل بمقدار 10 إلى 20 ضعفًا وعدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أقل مقارنةً بالمجموعة الأصلية، مما ينتج عنه غلة مكتبة أعلى بكثير، دون المساس بجودتها. س: هل من الممكن تقليل حجم الخرز المضاف خلال خطوة تنقية تخليق السلسلة الثانية؟ ج: يبلغ الحجم الإجمالي للعينة عند إضافة الخرز خلال خطوة تنقية تخليق السلسلة الثانية 224 ميكرولتر، وهو ما قد يتجاوز حجم بعض أنابيب وألواح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) سعة 0.2 مل. بالإضافة إلى ذلك، قد لا يسمح هذا الحجم بفصل الخرز بشكل كامل باستخدام بعض المغناطيسات. تتمتع العديد من ألواح وأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات القيمة الاسمية 0.2 مل بسعة فعلية أكبر تستوعب عينة بحجم 224 ميكرولتر. مع ذلك، إذا كان اللوح أو الأنبوب الذي تفضل استخدامه لا يتسع لحجم عينة 224 ميكرولتر، فمن الممكن تقليل حجم الخرز إلى 1.5 ضعف (120 ميكرولتر) ليصبح الحجم الإجمالي للسائل 200 ميكرولتر فقط. لم نلاحظ أي انخفاض في إنتاجية المكتبة النهائية. س: ماذا أفعل إذا رأيت راسبًا في محلول تفاعل تحضير نهايات الحمض النووي Ultra II؟ ج: من الشائع رؤية راسب أبيض في محلول إصلاح نهايات الحمض النووي Ultra II. في هذه الحالة، اترك المزيج حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم الماصة لسحب المحلول عدة مرات لتفتيت الراسب، ثم قم برجّه سريعًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي.