نيو إنجلاند بيولابس، E7775S، NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads

الفئات ذات الصلة: تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) لتقنية Illumina. المواصفات: المواد المطلوبة (غير متوفرة): أوليغومرات NEBNext أحادية أو متعددة لتقنية Illumina (NEB.com/oligos) أو أوليغومرات يوفرها العميل. حامل أو صفيحة مغناطيسية (مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext® (NEB #S1515S)، أو صفيحة Alpaqua® 96S المغناطيسية الفائقة (#A001322)، أو ما يعادلها). إيثانول 80% (مُحضر حديثًا). جهاز التدوير الحراري. وحدة العزل المغناطيسي للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) متعدد الأدينين NEBNext (NEB #E7490) أو مجموعة استنزاف الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) الإصدار 2 (بشري/فأري/جرذي) NEBNext (NEB #E7400 أو NEB #E7405) أو مجموعة استنزاف الغلوبين والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (بشري/فأري/جرذي) NEBNext (NEB #E7750 أو NEB #E7755) أو NEBNext® مجموعة استنفاد الحمض النووي الريبوزي (للبكتيريا) (NEB #E7850 أو NEB #E7860) أو مجموعة كواشف استنفاد الحمض النووي الريبوزي الأساسية NEBNext® (NEB #E7865 أو NEB #E7870) أو مجموعة استنفاد الحمض النووي الريبوزي NEBNext (للبشر/الفأر/الجرذ) (NEB #E6310 أو NEB #E6350) الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي NEBNext Ultra II مع خرز تنقية العينات (NEB #E7775) وتحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الاتجاهي NEBNext Ultra II مع خرز تنقية العينات (NEB #E7765)؟ ج: تحافظ آلية عمل تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي الاتجاهي NEBNext Ultra II على معلومات حول اتجاه سلسلة الحمض النووي الريبوزي، بينما لا تفعل آلية عمل تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي NEBNext Ultra II ذلك. تحتوي مجموعة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي الاتجاهي NEBNext Ultra II على dUTP في محلول تخليق السلسلة الثانية، مما يسمح بوسم الحمض النووي التكميلي (cDNA) للسلسلة الثانية واستئصاله لاحقًا باستخدام إنزيم USER. س: ما هي المادة الأولية التي أحتاجها عند تحضير المكتبات باستخدام مجموعة NEBNext Ultra II لتحضير الحمض النووي الريبوزي الاتجاهي؟ ج: المادة الأولية هي الحمض النووي الريبوزي الكلي (10 نانوغرام - 1 ميكروغرام)؛ أو الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المعزول مسبقًا (1-100 نانوغرام) أو الحمض النووي الريبوزي المستنفد من الريبوسومات (1-100 نانوغرام). س: ما هي المجموعة التي يمكنني استخدامها لعزل الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين (poly(A)) من الحمض النووي الريبوزي الكلي؟ ج: لعزل الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين من الحمض النووي الريبوزي الكلي، استخدم وحدة العزل المغناطيسي للحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين NEBNext (NEB #E7490). س: ما هي المجموعة التي يمكنني استخدامها لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) من الحمض النووي الريبوزي البشري أو الفأري أو الجرذي؟ ج: لإزالة الحمض النووي الريبوزي (rRNA) من الإنسان أو الفأر أو الجرذ، استخدم مجموعة NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (الإنسان/الفأر/الجرذ) (NEB #7400). س: هل من الممكن تقليل حجم الخرز المضاف خلال خطوة تنقية تخليق السلسلة الثانية من بروتوكول E7760 وE7765 وE7770 وE7775؟ ج: يبلغ الحجم الإجمالي للعينة عند إضافة الخرز خلال خطوة تنقية تخليق السلسلة الثانية 224 ميكرولتر، وهو ما قد يتجاوز حجم بعض أنابيب وألواح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) سعة 0.2 مل. إضافةً إلى ذلك، قد لا يسمح هذا الحجم بفصل الخرز بشكل كامل باستخدام بعض أنواع المغناطيس. تتمتع العديد من ألواح وأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات السعة الاسمية 0.2 مل بسعة فعلية أكبر تستوعب عينة بحجم 224 ميكرولتر. مع ذلك، إذا كانت الصفيحة أو الأنبوب الذي تفضل استخدامه لا يسمح بحجم عينة 224 ميكرولتر، فمن الممكن تقليل حجم الخرز إلى 1.5 × (120 ميكرولتر) ليصبح إجمالي حجم السائل 200 ميكرولتر فقط. س: هل يمكنني استخدام مجموعة NEBNext هذه مع محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB؟ ج: نعم، من الممكن استخدام محولات وبادئات من موردين آخرين غير NEB مع مجموعة NEBNext هذه. يجب أن يكون المحول من نوع T overhang، وقد يكون مردود المكتبة النهائي أقل قليلاً من استخدام محولات NEBNext الخاصة بـ Illumina®. يمكن الاطلاع على تعليمات الاستخدام مع المحولات غير التابعة لـ NEBNext، والمشفرة بالكامل، وبادئات P5 وP7 العالمية لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في كتيبات محولات NEBNext المفهرسة/UMI. يمكنك العثور على هذه الأدلة على الرابط neb.com/E7416 (RNA) أو neb.com/E7395 (DNA). اختر دليل مجموعة NEBNext التي ستستخدمها. كُتبت هذه الأدلة خصيصًا لمحولات NEBNext المفهرسة/UMI، وينبغي أن يعمل البروتوكول نفسه مع محولات أخرى ذات تصميم مشابه. نوصي بإجراء تجربة أولية باستخدام مجموعة تحضير المكتبة المطلوبة والمحولات المفهرسة المطلوبة، واستخدام عينات قابلة للاستهلاك لتحسين ظروف التجربة. س: ماذا أفعل إذا رأيت راسبًا في محلول تفاعل تحضير النهاية Ultra II؟ ج: من الشائع رؤية راسب أبيض في محلول إصلاح النهاية Ultra II. في هذه الحالة، اترك الخليط حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم الماصة عدة مرات لسحب المحلول وتفتيت الراسب، ثم قم برجّه سريعًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. س: هل من الممكن تقليل حجم الخرز المضاف خلال خطوة تنظيف تخليق السلسلة الثانية؟ ج: يبلغ الحجم الإجمالي للعينة عند إضافة الخرز خلال خطوة تنقية تخليق السلسلة الثانية 224 ميكرولتر، وهو ما قد يتجاوز حجم بعض أنابيب وألواح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) سعة 0.2 مل. إضافةً إلى ذلك، قد لا يسمح هذا الحجم بفصل الخرز بشكل كامل باستخدام بعض المغناطيسات. تتمتع العديد من ألواح وأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات السعة الاسمية 0.2 مل بسعة فعلية أكبر تستوعب عينة بحجم 224 ميكرولتر. مع ذلك، إذا كان اللوح أو الأنبوب الذي تفضل استخدامه لا يتسع لحجم عينة 224 ميكرولتر، فمن الممكن تقليل حجم الخرز إلى 1.5 × (120 ميكرولتر) ليصبح الحجم الإجمالي للسائل 200 ميكرولتر فقط. لم نلاحظ أي انخفاض في إنتاجية المكتبة النهائية. س: ما هو تركيب البادئات العشوائية؟ ج: البادئات العشوائية عبارة عن سداسيات عشوائية متوفرة بتركيز 1.9 ملي مولار. س: هل تتضمن المجموعة محولًا وبادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام هذه المجموعة مع NEBNext Multiplex Oligos for Illumina. للاطلاع على القائمة الكاملة، راجع مخطط اختيار NEBNext® Multiplex Oligos. لاستخدامها مع مجموعات تحضير مكتبات NEBNext، راجع دليل مجموعة تحضير المكتبات. تحتوي الأدلة الخاصة بمجموعة multiplex oligo أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات PCR. للاطلاع على خيارات موازنة الألوان، يُرجى مراجعة NEBNext® Index Oligo Selector للاطلاع على تركيبات الباركود الصالحة.