نيو إنجلاند بيولابس، E7850X، مجموعة استنفاد الحمض النووي الريبوزي NEBNext® (بكتيريا)

يُعدّ الحمض النووي الريبوزي (rRNA) وفيرًا جدًا في العينات البكتيرية، ويُستحسن إزالته للكشف عن الأهمية البيولوجية للنسخ الأقل وفرة. يُمثّل الإثراء النوعي للرنا المرسال البكتيري تحديًا نظرًا لافتقاره إلى ذيول متعددة الأدينين، ولذا فإنّ العكس - أي الإزالة الفعّالة والنوعية للرنا الريبوزي البكتيري - ضروري. الفئات ذات الصلة : استنزاف الحمض النووي الريبوزي وإثراء الرنا المرسال، تحليل ما فوق النسخ، تحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي لتقنية Illumina، المواصفات . المواد المطلوبة (غير مُرفقة ): حامل مغناطيسي (NEB #S1515) أو صفيحة مغناطيسية (Alpaqua. cat. #A001322) أو ما يُعادلها، إيثانول 80% (مُحضّر حديثًا)، جهاز تدوير حراري، أي أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) رقيقة الجدران سعة 200 ميكرولتر وأنابيب سعة 1.5 مل، جهاز التحليل الحيوي، Tapestation. (شركة Agilent Technologies) أو جهاز ومواد استهلاكية مماثلة، خرز Agencourt® RNAClean® XP (شركة Beckman Coulter، رقم A63987). الأسئلة الشائعة : س: ما هي وحدات الحمض النووي الريبوزي (rRNA) البكتيرية التي يتم استنزافها باستخدام مجموعة NEBNext rRNA Depletion Kit للبكتيريا؟ ج: تستنزف المجموعة وحدات 5S و16S و23S من الحمض النووي الريبوزي (rRNA). س: هل يمكن استخدام مجموعة NEBNext® rRNA Depletion Kit (للبكتيريا) على عينات الميتا-ترانسكريبتوم؟ ج: نعم، نظرًا لأن المجسات مصممة ضد الحمض النووي الريبوزي (rRNA) من عدة أنواع، فسيكون الاستنزاف فعالًا على كل من المزارع الأحادية والمجتمعات الميكروبية المختلطة (موجبة وسالبة الجرام). س: كيف يمكنني إزالة الحمض النووي الريبوزي (rRNA) من مزيج من عينات الثدييات والبكتيريا؟ ج: يمكن مزج كميات متساوية من المجسات من مجموعة NEBNext® rRNA Depletion Kit v2 (بشري/فأري/جرذي) (NEB #E7400/E7405) أو مجموعة NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit (بشري/فأري/جرذي) (NEB #E7750/E7755) مع المجسات من مجموعة NEBNext® rRNA Depletion Kit (بكتيريا) لإزالة الحمض النووي الريبوزي من العينة المختلطة. ويمكن زيادة كمية المجسات تبعًا لكمية الحمض النووي الريبوزي للثدييات مقارنةً بالحمض النووي الريبوزي للبكتيريا. يُرجى مراجعة المعلومات هنا. س: ما هي نسبة الحمض النووي الريبوزي البكتيري المتبقي بعد الإزالة؟ ج: تختلف نسبة الحمض النووي الريبوزي البكتيري المتبقي بعد الإزالة باختلاف العينة. بالنسبة للعديد من الأنواع المختلفة، نتوقع أن نرى ما بين 1% و5% من الحمض النووي الريبوزي المتبقي. مع ذلك، قد تُلاحظ نسبة أعلى من الحمض النووي الريبوزي (rRNA) اعتمادًا على تنوع النوع وتسلسل الحمض النووي الريبوزي الخاص به. س: كيف يمكنني تحديد ما إذا كان استنفاد الحمض النووي الريبوزي فعالًا؟ ج: لتقييم كفاءة الاستنفاد، صمم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR) للحمض النووي الريبوزي الخاص بالنوع المدروس، وبادئات لجين مرجعي. قارن محتوى الحمض النووي الريبوزي قبل الاستنفاد وبعده. س: هل يمكنني استخدام هذا المنتج مع الحمض النووي الريبوزي المتدهور أو المجزأ؟ ج: نعم، يمكن استخدام هذه المجموعة مع الحمض النووي الريبوزي المتدهور أو المجزأ. س: ما هي كمية الحمض النووي الريبوزي الكلية التي يجب استخدامها؟ ج: تم تحسين المجموعة لاستخدام كمية تتراوح بين 10 و1000 نانوغرام من الحمض النووي الريبوزي الكلي (100 نانوغرام كحد أدنى للحمض النووي الريبوزي المجزأ أو المتدهور). بالنسبة لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)، نوصي باستخدام كميات أكبر من 100 نانوغرام لزيادة تعقيد المكتبة وتقليل معدل التكرار. س: لماذا يجب أن يكون الحمض النووي الريبوزي خاليًا من الحمض النووي (DNA)؟ ج: قد يؤدي تلوث الحمض النووي إلى عدم دقة قياس كمية الحمض النووي الريبوزي (RNA) وإعاقة الإزالة السليمة للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) للغلوبين. س: ما هو مجتمع الميكروبيوم المستخدم في تجارب الاستنزاف الموصوفة، وما هي المراجع المستخدمة لتقييم أداء مجموعة NEBNext® لاستنزاف الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (البكتيريا) مع هذه العينة؟ ج: تم استخدام مادة الخلايا الكاملة ATCC 20 Strain Even Mix (ATCC® MSA-2002™) في تجربة الاستنزاف. تم إنشاء جينوم مرجعي مركب من جينومات NCBI لتقييم أداء المجموعة. المرجع المركب متاح على الرابط التالي: https://doi.org/10.5281/zenodo.3386404 س: هل يمكنني استخدام خرز Agencourt® AMPure® XP المغناطيسي بدلاً من خرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي NEBNext® (خرز RNAClean® XP المغناطيسي)؟ ج: نعم، من الممكن استخدام خرز AMPure XP. مع ذلك، نوصي باستخدام خرز RNAClean XP / خرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي NEBNext® (المرفقة في عبوة NEB رقم E7860) حيث تم تصنيع هذه الخرزات واختبارها خصيصًا للقضاء على تلوث RNase. يتضمن إصدار من المجموعة هذه الخرزات: مجموعة NEBNext® لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي (للبكتيريا) مع خرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي (NEB رقم E7860). سؤال: هل يمكنني استخدام طرق تنقية أخرى غير خرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي NEBNext® / خرز Agencourt® RNAClean® XP المغناطيسي؟ ج: على الرغم من أننا نوصي باستخدام خرز RNAClean® XP وخرز تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي NEBNext® (المرفقة في عبوة NEB رقم E7755)، إلا أنه يمكن تنقية العينات المستنفدة من الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) عن طريق الترسيب بالإيثانول أو باستخدام أدوات تنقية أعمدة الحمض النووي الريبوزي مثل مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (NEB رقم T2030). للاستخدام مع أعمدة أخرى، يُرجى مراجعة مواصفات العمود لمعرفة نطاق حجم الحمض النووي الريبوزي لضمان الاحتفاظ بأي حمض نووي ريبوزي مجزأ أثناء عملية التنقية. س: ما هي الأنواع التي تم اختبارها باستخدام مجموعة NEBNext لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (البكتيريا)؟ ج: يمكن الاطلاع على معلومات حول الأنواع التي تم اختبارها حتى الآن هنا. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي المُخصب الناتج عن مجموعة NEBNext لاستنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي في تطبيقات تسلسل القراءة الطويلة؟ ج: نعم، ولكن تجدر الإشارة إلى أن الحمض النووي الريبوزي يتعرض لبعض التجزئة أثناء عملية الاستنفاد، مما قد يُقلل من طول القراءة.