مجموعة نيو إنجلاند بيولابس E8015S، NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2

جهاز NEBNext لتحليل مثيلة الحمض النووي (EM-seq) - الفئات ذات الصلة : التحويل الإنزيمي لتحليل مثيلة الحمض النووي، تحليل الميثيلوم، تحليل مثيلة الحمض النووي. المواصفات : المواد المطلوبة (غير المرفقة) : جهاز NEBNext UltraShear® (M7634) أو Covaris® والأنابيب المطلوبة أو معدات التجزئة الأخرى، أنابيب شرائح تفاعل البوليميراز المتسلسل أو صفائح 96 بئراً، خرز التنظيف: مجموعة كواشف SPRIselect (Beckman Coulter®، Inc. #B23317)، خرز AMPure® XP (Beckman Coulter، Inc. #A63881) أو خرز Hi-Di™ من الشركة المصنعة المفضلة (Thermo Fisher Scientific® #4401457)، فورماميد (Sigma #F9037-100 مل)، أو هيدروكسيد الصوديوم 0.05 مولار. يُفضل استخدام الفورماميد. في حال استخدام هيدروكسيد الصوديوم، يُرجى مراجعة الأسئلة الشائعة المتعلقة بجهاز NEB #E8015. إيثانول 80% 10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 7.5 أو 8.0 أو محلول TE منخفض (10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0، 0.1 ملي مولار EDTA) ماء خالٍ من النيوكلياز حامل/قاعدة مغناطيسية، مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext (NEB #S1515) كتلة تبريد معدنية، مثل Diversified Biotech® (#CHAM-1000) جهاز PCR الأسئلة الشائعة س: ما الفرق بين مجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8015) ومجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq الأصلية (NEB #E7120)؟ ج: تتميز مجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq v2 بنطاق إدخال أوسع (100 بيكوغرام - 200 نانوغرام) وسير عمل أسرع وأكثر سلاسة يقلل من استخدام المواد الاستهلاكية. كما تتحسن جودة البيانات بشكل عام، مع زيادة الإنتاجية وانخفاض معدلات التكرار مما يؤدي إلى زيادة مستويات تغطية CpG عبر نطاق إدخال أوسع. س: ما الفرق بين مجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8015) ووحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8020)؟ ج: تحتوي مجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq v2 على المكونات اللازمة لإنشاء مكتبة EM-seq™، بما في ذلك الكواشف اللازمة لتحضير النهايات، وربط المحولات، وحماية 5mC/5hmC، وإزالة أمين السيتوزين، ومزيج NEBNext Q5U الرئيسي للتضخيم. يمكن دمج مجموعة EM-seq v2 مع أي من بادئات LV Unique Dual Index. لا تحتوي وحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq v2 على كواشف لتحضير المكتبة أو التضخيم أو المحولات والبادئات. س: ما أنواع العينات التي يمكن معالجتها باستخدام مجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB س: ما هي المدخلات الموصى بها لمجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8015) ووحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8020)؟ ج: يمكن استخدام NEBNext Enzymatic Methyl-seq مع الحمض النووي الجينومي، والحمض النووي الخالي من الخلايا، والحمض النووي FFPE. س: ما هي المدخلات الموصى بها لمجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8015) ووحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8020)؟ ج: تم تحسين البروتوكول لمدخلات تتراوح بين 0.1 و200 نانوغرام. س: ما هي المحاليل المنظمة الموصى بها لتقطيع الحمض النووي في سير عمل NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (EM-seq™)؟ ج: للاستخدام مع مجموعات NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (NEB #E7120، #E8015)، يجب تقطيع الحمض النووي في أحد المحاليل المنظمة التالية: 10 يُستخدم محلول Tris-HCl بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 7.5 أو 8.0، أو محلول TE بتركيز 1X (10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0، 1 ملي مولار EDTA)، أو محلول TE منخفض التركيز (10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0، 0.1 ملي مولار EDTA). لا نوصي بتقطيع الحمض النووي المُدخل في محلول TE بتركيز 0.1X (1 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA) أو الماء. عند استخدام وحدات تحويل ميثيل-سيك الإنزيمية NEBNext (NEB #E7125، #E8020)، يجب ألا يكون الحمض النووي في محلول منظم يحتوي على EDTA قبل البدء بتفاعل الأكسدة. لذلك، يُوصى بتقطيع الحمض النووي في محلول Tris بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 8.0. بدلاً من ذلك، في حال التقطيع في محلول TE بتركيز 1X أو محلول TE منخفض التركيز، يُنصح بتنظيف العمود أو الخرز، ثم الإذابة في محلول Tris بتركيز 10 ملي مولار. يلزم استخدام محلول Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0 أو ماء خالٍ من النيوكلياز. س: ما هو تركيز محول EM-seq™ وبادئات NEBNext® LV الفريدة ذات الفهرس المزدوج؟ ج: تركيز محول EM-seq هو 15 ميكرومولار، وتركيز بادئات LV الفريدة ذات الفهرس المزدوج هو 10 ميكرومولار. س: هل يمكن تخزين محلول TET2 النشط لأكثر من 4 أشهر؟ ج: لا. يجب التخلص من محلول TET2 النشط بعد 4 أشهر. س: هل يمكن تخزين T4-BGT المخفف حديثًا لفترة طويلة؟ ج: لا. يجب التخلص من T4-BGT المخفف حديثًا فور استخدامه. س: ما هو الحجم المتوقع لمكتبة EM-seq™ v2 (NEB #E8015)؟ ج: يبلغ حجم مكتبات EM-seq v2 حوالي 470-550 زوجًا قاعديًا. س: كيف يجب تسلسل مكتبات EM-seq؟ ج: لـ في تسلسل Illumina، يتحدد طول القراءة في النهاية بحجم المكتبة. يمكن تسلسل المكتبات ذات الحجم القياسي باستخدام قراءتين بطول 76 قاعدة أو قراءتين بطول 100 قاعدة. ويمكن استخدام قراءتين بطول 150 قاعدة للمكتبات ذات الإدخالات الأطول. س: كيف ينبغي تحليل بيانات تسلسل EM-seq™؟ ج: تعطي مكتبات EM-seq المُسلسلة نفس مخرجات مكتبات البيسلفيت، حيث يُسلسل السيتوزين على أنه ثايمين، ويُسلسل 5mC أو 5hmC على أنه سيتوزين. يمكن استخدام مسارات العمل المُعتمدة لتحليل بيانات البيسلفيت. لدينا أيضًا مسار عمل تجريبي وبيانات نموذجية على مكتبة GitHub: https://github.com/nebiolabs/EM-seq/ س: هل يمكن استبدال مُهايئ EM-seq بمُهايئ آخر؟ ج: لا يُنصح بذلك. تم تحسين مُهايئ EM-seq للاستخدام مع مجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq، ولا يُنصح باستبداله بمُهايئ آخر. من المرجح أن يؤدي ذلك إلى انخفاض الأداء. س: هل مكتبات EM-seq موجهة أم غير موجهة؟ ج: مكتبات EM-seq موجهة. س: هل يمكن استخدام محاليل أخرى بدلاً من محلول الإذابة المرفق مع EM-seq؟ ج: يجب استخدام محلول الإذابة الخاص بـ EM-seq حيثما هو مذكور في البروتوكول، باستثناء حالة التخزين طويل الأمد لمكتبات EM-seq المُضخمة بتقنية PCR، حيث تتوفر خيارات أخرى (محددة في الدليل). س: كيف يتم تحضير مكتبات EM-seq™ من الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA)؟ ج: لا يتطلب cfDNA تجزئة قبل تحضير المكتبة. كما هو موضح في دليل المنتج، يمكن نقل 0.1 إلى 200 نانوغرام من cfDNA مباشرةً إلى سير عمل EM-seq v2. يمكن إضافة الحمض النووي المُجزأ مسبقًا، ولامدا غير المُمَثْيَل، وpUC19 المُمَثْيَل CpG إلى cfDNA قبل خطوة تحضير النهاية. س: هل يمكن تحضير المكتبات من الحمض النووي المُثبت بالفورمالين والمُضمن في البارافين (FFPE)؟ هل تستخدم مجموعة NEBNext® EM-seq v2؟ ج: نعم، يمكن تحضير المكتبات باستخدام 0.1-200 نانوغرام من الحمض النووي المستخلص من الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين (FFPE). يجب تقطيع الحمض النووي، ويجب بناء المكتبات وفقًا لدليل EM-seq v2. قد يلزم تحسين دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ولكننا نوصي بزيادة عددها بمقدار دورتين على الأقل. تجدر الإشارة إلى أن المكتبات المحضرة من الحمض النووي المستخلص من الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين قد تحتوي على مستويات أعلى من مثيلة الحمض النووي في سياقي CHH وCHG. ومع ذلك، فإن استخدام مرشح 3C (المتوفر في برنامج Bismark) أو ما شابه يقلل من هذه الخلفية. يزيل المرشح القراءات التي تحتوي على 3 قواعد سيتوزين متتالية أو أكثر غير محولة في سياق غير CpG (أي CHG/CHH). س: ما هي مستويات التحويل النموذجية مع الحمض النووي المرجعي المرفق في مجموعات EM-seq™ v2؟ ج: يتم توفير نوعين من الحمض النووي المرجعي في مجموعة EM-seq v2: الحمض النووي لامدا غير المثيل والحمض النووي pUC19 المثيل في CpG. عند استخدام مدخلات نانوغرامية، نلاحظ مثيلة ≤ 0.5%، وعند استخدام مدخلات 0.1 نانوغرامية، نلاحظ مثيلة ≤ 1% لعينة لامدا غير المثيلة، مما يشير إلى كفاءة تحويل تبلغ 99.5% و99% على التوالي. بالنسبة لـ pUC19 المثيل بـ CpG، يتم الكشف عن مثيلة CpG بنسبة 96-98% عبر نطاق المدخلات من 0.1 إلى 200 نانوغرام. نظرًا لأن حمض pUC19 النووي مثيل إنزيميًا، فمن المحتمل ألا يتم تحقيق مثيلة بنسبة 100%، وألا تكون جميع مواقع CpG مثيلة. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي المجزأ إنزيميًا كمادة إدخال لـ EM-seq™ v2؟ ج: NEBNext UltraShear® هو كاشف التجزئة الإنزيمي الوحيد الذي نوصي به قبل بدء عملية EM-Seq. لا نوصي بطرق التجزئة الأخرى القائمة على الإنزيمات لأنها قد تؤثر على علامات مثيلة الحمض النووي. عند استخدام جهاز NEBNext UltraShear مع EM-seq v2، يُرجى اتباع التوصيات الواردة في دليل UltraShear. س: هل تتوفر أوراق العينات مع بادئات NEBNext® LV الفريدة ذات الفهرس المزدوج؟ ج: يمكن العثور على أوراق العينات في قسم إرشادات الاستخدام في صفحة المنتج. س: هل يمكنني استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بدلاً من الفورماميد لفصل سلسلتي الحمض النووي قبل تفاعل إزالة الأمين؟ ج: هل يمكنني استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بدلاً من الفورماميد لفصل سلسلتي الحمض النووي قبل تفاعل إزالة الأمين؟ نعم، من الممكن استخدام هيدروكسيد الصوديوم، على الرغم من أن الفورماميد يُوصى به لسهولة التعامل معه. في حال استخدام هيدروكسيد الصوديوم، يجب أن يكون تركيز محلول هيدروكسيد الصوديوم دقيقًا، وأن يكون الحجم المُضاف إلى التفاعل 4 ميكرولتر بالضبط. هيدروكسيد الصوديوم مادة شديدة التآكل. يجب اتباع إرشادات السلامة المحلية والمؤسسية عند التعامل مع هيدروكسيد الصوديوم. إذا كنت تُحضّر محلولًا مُخففًا من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 2 مولار، فتأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي لا يقل عن 12.5. تحقق من ذلك. اضبط درجة حموضة المحلول الأصلي قبل الاستخدام. تجنب التخفيفات غير الدقيقة بتحضير حجم كافٍ من محلول هيدروكسيد الصوديوم المخفف لتقليل أخطاء السحب بالماصة. نوصي بتحضير 1 مل على الأقل. حضّر محاليل هيدروكسيد الصوديوم المخففة طازجة أو خزّن أجزاءً مخففة في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر لتجنب تغير التركيز. هيدروكسيد الصوديوم الصلب مادة متميعة (تمتص الماء من الجو). لا يمكن وزنه بدقة. لذلك، يجب معايرة المحاليل المحضرة من حبيبات هيدروكسيد الصوديوم للوصول إلى التركيز المناسب. س: هل المكتبات ذات الفهرسة المزدوجة متوافقة مع تسلسل القراءة المفردة؟ ج: نعم، تتوافق بادئات NEBNext Oligos الخاصة بـ Illumina، بما في ذلك بادئات الفهرسة المزدوجة، مع تسلسل القراءة المفردة. يرجى الرجوع إلى دليل نظرة عامة على التسلسل المفهرس من Illumina (الإصدار الحالي) للحصول على تفاصيل حول سير عمل التسلسل ذي الفهرسة المزدوجة على خلية تدفق القراءة المفردة أو خلية تدفق القراءة المزدوجة. س: هل من الطبيعي أن يكون لون محلول الحديد الثنائي من منتج EM-seq™ أصفر؟ س: هل لوحظ تغير في اللون؟ ج: نعم، لوحظ تغير في اللون (من عديم اللون إلى أصفر). أظهرت الاختبارات عدم وجود فرق في الأداء بناءً على هذا التغير. س: ما النسبة المئوية المطلوبة من PhiX لمكتبات EM-seq™؟ ج: راجع توصيات Illumina®. لقد حققنا نجاحًا مع النسب المئوية التالية من PhiX: NovaSeq®: 5% PhiX، NextSeq® 2000: 5% PhiX، NextSeq 500/550: 35% PhiX، MiSeq®: 5% PhiX. س: كيف يمكن إضافة عناصر التحكم قبل القص إلى الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) أو غيره من الحمض النووي المجزأ مسبقًا (المضخمات، الحمض النووي المهضوم بالإنزيمات القاطعة، إلخ) قبل إدخالها في سير عمل EM-seq™؟ ج: قص عناصر التحكم غير الميثيلية من لامدا وعناصر التحكم الميثيلية من نوع pUC19 لإضافتها إلى الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) أو غيره من الحمض النووي المجزأ مسبقًا (المضخمات، الحمض النووي المهضوم بالإنزيمات القاطعة، إلخ) كما يلي: 10 10 ميكرولتر من الحمض النووي الضابط غير المُمَثْيَل لامدا (2 نانوغرام/ميكرولتر) 10 ميكرولتر من الحمض النووي الضابط المُمَثْيَل CpG pUC19 (0.1 نانوغرام/ميكرولتر) 30 ميكرولتر من محلول Tris-HCl بتركيز 15 ملي مولار ودرجة حموضة 8.0. يُقَطَّع الحمض النووي إلى حجم متوسط ​​يبلغ 350 زوجًا قاعديًا. يُعادل حجم الحمض النووي الضابط (الحمض النووي الضابط المُمَثْيَل CpG pUC19 (0.1 نانوغرام/ميكرولتر) والحمض النووي الضابط غير المُمَثْيَل لامدا (2 نانوغرام/ميكرولتر)) المُقَطَّع في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر تخفيفًا بنسبة 1:5. لذلك، لتخفيف هذه الضوابط المُقَطَّعة مسبقًا بشكل أكبر، على سبيل المثال إلى تخفيف بنسبة 1:10، يلزم تخفيف إضافي بنسبة 1:2. ملاحظة: يتوفر الحمض النووي الضابط غير المُمَثْيَل لامدا والحمض النووي الضابط المُمَثْيَل CpG pUC19 في محلول Tris بتركيز 1 ملي مولار ودرجة حموضة 7.5 و0.1 ملي مولار على التوالي. محلول منظم يحتوي على EDTA. من الضروري وجود 10 ملي مولار على الأقل من Tris عند تجزئة هذه العينات الضابطة باستخدام طرق القص الميكانيكي مثل Covaris. استخدام محلول منظم بتركيز Tris أقل من 10 ملي مولار أثناء القص يؤدي إلى تغيير في مقاييس التحويل، وقد لا تكون كفاءة التحويل المُقاسة دقيقة. س: كيف ينبغي تخفيف العينات الضابطة للتطبيقات التي تتضمن التسلسل السطحي؟ ج: بالنسبة للتطبيقات التي يتم فيها التسلسل بعمق أقل من 10 ملايين قراءة مزدوجة، نوصي بتخفيف العينات الضابطة وفقًا لكمية العينة المُدخلة كما يلي: 200 نانوغرام: بدون تخفيف للحمض النووي الضابط، 10 نانوغرام: تخفيف بنسبة 1:10 للحمض النووي الضابط، 1 نانوغرام: تخفيف بنسبة 1:25 للحمض النووي الضابط، 0.1 نانوغرام: تخفيف بنسبة 1:25 للحمض النووي الضابط. نوصي بوجود 5000 قراءة على الأقل تُطابق جينوم لامدا غير المُمَثْيَل و500 قراءة تُطابق جينوم pUC19 المُمَثْيَل CpG جينوم بطول قراءة 76 قاعدة للحصول على تغطية كافية لتحديد كفاءة التحويل بثقة. س: ماذا أفعل إذا لاحظت وجود ثنائيات محولات في مكتبات EM-seq™ v2؟ ج: قد تلاحظ أحيانًا وجود ثنائيات محولات في عينات الإدخال المنخفضة. يمكن إجراء تنظيف إضافي بمقدار 0.8X للمكتبات الفردية أو مجموعة المكتبات. س: هل يمكن تخزين محلول الحديد الثنائي المخفف حديثًا لفترة طويلة؟ ج: لا. يجب التخلص من محلول الحديد المخفف حديثًا فور استخدامه. س: هل تتضمن المجموعة بادئات؟ ج: لا. يمكن استخدام المجموعة مع بادئات NEBNext LV الفريدة ذات الفهرس المزدوج. للاطلاع على قائمة كاملة ببادئات الفهرس المزدوج الفريدة منخفضة الحجم (LV)، يرجى مراجعة العمود الثالث من مخطط اختيار قليل النوكليوتيدات المتعددة NEBNext®. للاستخدام مع مجموعات تحضير مكتبات NEBNext، راجع دليل مجموعة تحضير المكتبات. تحتوي أدلة بادئات NEBNext LV الفريدة ذات الفهرس المزدوج أيضًا على نصائح لإعداد تفاعلات الربط. للاطلاع على خيارات موازنة الألوان، يرجى مراجعة NEBNext® Index Oligo Selector للحصول على مجموعات الباركود الصالحة.