وحدة تحويل الميثيل-سيك الإنزيمية NEBNext® الإصدار الثاني، من شركة نيو إنجلاند بيولابس، طراز E8020S

يُعدّ NEBNext Enzymatic Methyl-seq (EM-seq™) بديلاً عالي الأداء يعتمد على الإنزيمات لتحويل البيسلفيت لتحديد 5mC و5hmC. وعلى عكس تحويل البيسلفيت، تُقلّل هذه الطريقة عالية الكفاءة من تلف الحمض النووي، مما يؤدي إلى كشف فائق للسيتوزينات الميثيلية، مع عدد أقل من قراءات التسلسل. الفئات ذات الصلة: التحويل الأنزيمي لتحليل مثيلة الحمض النووي، تحليل الميثيلوم، تحليل مثيلة الحمض النووي، المواصفات . المواد المطلوبة (غير المرفقة): جهاز NEBNext UltraShear® (M7634) أو Covaris® والأنابيب المطلوبة أو معدات التجزئة الأخرى، أنابيب شرائح تفاعل البوليميراز المتسلسل أو صفائح 96 بئرًا، خرزات التنظيف: مجموعة كواشف SPRIselect (Beckman Coulter®، Inc. #B23317)، خرزات AMPure® XP (Beckman Coulter، Inc. #A63881) أو خرزات Hi-Di™ من الشركة المصنعة المفضلة (Thermo Fisher Scientific® #4401457)، فورماميد (Sigma #F9037-100 مل)، أو هيدروكسيد الصوديوم 0.05 مولار. يُفضل استخدام الفورماميد. في حال استخدام هيدروكسيد الصوديوم، يُرجى مراجعة الأسئلة الشائعة المتعلقة بجهاز NEB #E8015. 80% إيثانول، 10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 7.5 أو 8.0 أو محلول TE منخفض (10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0، 0.1 ملي مولار EDTA)، ماء خالٍ من النيوكلياز، حامل مغناطيسي، مثل حامل الفصل المغناطيسي NEBNext (NEB #S1515)، كتلة تبريد معدنية، مثل Diversified Biotech® (#CHAM-1000)، جهاز PCR، الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين مجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8015) ووحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8020)؟ ج: تحتوي مجموعة NEBNext Enzymatic Methyl-seq v2 على المكونات اللازمة لإنشاء مكتبة EM-seq™، بما في ذلك الكواشف اللازمة لتحضير النهايات، وربط المحولات، وحماية 5mC/5hmC، وإزالة أمين السيتوزين، ومزيج NEBNext Q5U الرئيسي للتضخيم. يمكن دمج مجموعة EM-seq v2 مع أي من بادئات LV Unique Dual Index. لا تحتوي وحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq v2 على كواشف لتحضير المكتبة أو التضخيم أو المحولات والبادئات. س: ما أنواع العينات التي يمكن معالجتها باستخدام مجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8015) ووحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8020)؟ ج: يمكن استخدام NEBNext Enzymatic Methyl-seq مع الحمض النووي الجينومي، والحمض النووي الخالي من الخلايا، والحمض النووي FFPE. س: ما هي المدخلات الموصى بها لمجموعة NEBNext® Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8015) ووحدة تحويل Enzymatic Methyl-seq v2 (NEB #E8020)؟ ج: تم تحسين البروتوكول لمدخلات تتراوح بين 0.1 و200 نانوغرام. س: ما هي المحاليل المنظمة الموصى بها لتقطيع الحمض النووي في سير عمل NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (EM-seq™)؟ ج: لاستخدام مجموعات NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (NEB #E7120، #E8015)، يجب تقطيع الحمض النووي في أحد المحاليل المنظمة التالية: 10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 7.5 أو 8.0، أو 1X TE (10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0، 1 ملي مولار EDTA)، أو محلول TE منخفض التركيز (10 ملي مولار Tris-HCl بدرجة حموضة 8.0، 0.1 ملي مولار EDTA). لا نوصي بتقطيع الحمض النووي المدخل في محلول 0.1X TE (1 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA) أو الماء. عند استخدام وحدات تحويل NEBNext Enzymatic Methyl-seq (NEB #E7125، #E8020)، يجب ألا يكون الحمض النووي في محلول منظم يحتوي على EDTA قبل البدء بتفاعل الأكسدة. لذا، يُوصى بتقطيع الحمض النووي في محلول Tris بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 8.0. بدلاً من ذلك، في حال التقطيع في محلول TE بتركيز 1X أو تركيز منخفض من TE، يلزم تنظيف العمود أو الخرز، ثم الإذابة في محلول Tris-HCl بتركيز 10 ملي مولار ودرجة حموضة 8.0 أو في ماء خالٍ من النيوكلياز. س: ما هو تركيز مُحَوِّل EM-seq™ وبادئات NEBNext® LV الفريدة ذات الفهرسة المزدوجة؟ ج: تركيز مُحَوِّل EM-seq هو 15 ميكرومولار، وتركيز بادئات LV الفريدة ذات الفهرسة المزدوجة هو 10 ميكرومولار. س: هل يُمكن تخزين محلول TET2 النشط لأكثر من 4 أشهر؟ ج: لا. يجب التخلص من محلول TET2 النشط بعد 4 أشهر. س: هل يُمكن تخزين T4-BGT المخفف حديثًا لفترة طويلة؟ ج: لا. يجب التخلص من T4-BGT المخفف حديثًا فور استخدامه. س: ما هي مستويات التحويل النموذجية مع عينات الحمض النووي المرجعية المرفقة في مجموعات EM-seq™ v2؟ ج: تحتوي مجموعة EM-seq v2 على عينتين مرجعيتين من الحمض النووي: حمض نووي لامدا غير مثيل، وحمض نووي pUC19 مثيل في مواقع CpG. عند استخدام 200 نانوغرام من العينة، نلاحظ مثيلة ≤ 0.5%، وعند استخدام 0.1 نانوغرام، نلاحظ مثيلة ≤ 1% لحمض لامدا غير المثيل، مما يشير إلى كفاءة تحويل تبلغ 99.5% و99% على التوالي. أما بالنسبة لحمض pUC19 المثيل في مواقع CpG، فقد تم الكشف عن مثيلة CpG بنسبة 96-98% ضمن نطاق الإدخال من 0.1 إلى 200 نانوغرام. ونظرًا لأن حمض pUC19 يتم مثيلته إنزيميًا، فمن المحتمل ألا يتم الوصول إلى نسبة مثيلة 100%، وألا تكون جميع مواقع CpG مثيلة. س: هل يمكنني استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بدلاً من الفورماميد لفصل سلسلتي الحمض النووي (DNA) قبل تفاعل إزالة الأمين؟ ج: هل يمكنني استخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بدلاً من الفورماميد لفصل سلسلتي الحمض النووي (DNA) قبل تفاعل إزالة الأمين؟ نعم، من الممكن استخدام هيدروكسيد الصوديوم، على الرغم من أن الفورماميد يُوصى به لسهولة التعامل معه. في حال استخدام هيدروكسيد الصوديوم، يجب أن يكون تركيز محلول هيدروكسيد الصوديوم دقيقًا، وأن يكون الحجم المُضاف إلى التفاعل 4 ميكرولتر بالضبط. هيدروكسيد الصوديوم مادة شديدة التآكل. يجب اتباع إرشادات السلامة المحلية والمؤسسية عند التعامل مع هيدروكسيد الصوديوم. إذا كنت تُحضّر محلولًا مُخففًا من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 2 مولار، فتأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي لا يقل عن 12.5. تحقق من الرقم الهيدروجيني للمحلول الأصلي قبل الاستخدام. تجنب التخفيفات غير الدقيقة بتحضير حجم كافٍ من هيدروكسيد الصوديوم المُخفف لتقليل أخطاء السحب بالماصة. نوصي بتحضير 1 مل على الأقل. حضّر محاليل هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) المخففة طازجة أو خزّن أجزاءً مخففة منها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر لتجنب تغير التركيز. هيدروكسيد الصوديوم الصلب مادة متميعة (تمتص الرطوبة من الجو)، ولا يمكن وزنها بدقة. لذلك، يجب معايرة المحاليل المحضرة من حبيبات هيدروكسيد الصوديوم للوصول إلى التركيز المناسب. س: هل من الطبيعي أن يكون لون محلول الحديد الثنائي (Fe(II)) من منتج EM-seq™ أصفر أو أن يُلاحظ تغير في اللون؟ ج: نعم، لوحظ تغير في اللون (من عديم اللون إلى أصفر). أظهرت الاختبارات عدم وجود فرق في الأداء بناءً على هذا التغير. س: كيف يمكن إضافة عناصر التحكم قبل القص إلى الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) أو غيره من الحمض النووي المجزأ مسبقًا (المضخمات، الحمض النووي المهضوم بالإنزيمات القاطعة، إلخ) قبل إدخاله في سير عمل EM-seq™؟ أ: قم بتقطيع عينات التحكم لامدا غير الميثيلية و pUC19 الميثيلية CpG لإضافتها إلى cfDNA أو غيرها من الحمض النووي المجزأ مسبقًا (المضخمات، الحمض النووي المهضوم بالإنزيمات القاطعة، إلخ) على النحو التالي: 10 ميكرولتر من الحمض النووي للتحكم لامدا غير الميثيلية (2 نانوغرام/ميكرولتر) 10 ميكرولتر من الحمض النووي للتحكم pUC19 الميثيلية CpG (0.1 نانوغرام/ميكرولتر) 30 ميكرولتر من Tris-HCl 15 ملي مولار pH 8.0 قم بالتقطيع إلى حجم متوسط ​​يبلغ 350 زوجًا قاعديًا. الحمض النووي للتحكم (مزيج الحمض النووي للتحكم pUC19 الميثيلية CpG (0.1 نانوغرام/ميكرولتر) والحمض النووي للتحكم لامدا غير الميثيلية (2 نانوغرام/ميكرولتر)) المقطع في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر يعادل تخفيفًا بنسبة 1:5. لذا، لتخفيف هذه العينات الضابطة المجزأة مسبقًا، على سبيل المثال إلى تخفيف 1:10، يلزم تخفيفها مرة أخرى بنسبة 1:2. ملاحظة: يتم توفير عينات الحمض النووي الضابطة Lambda غير المُمَثْيَل وpUC19 المُمَثْيَل CpG في محلول منظم يحتوي على 1 ملي مولار من Tris بدرجة حموضة 7.5 و0.1 ملي مولار من EDTA. من الضروري وجود 10 ملي مولار على الأقل من Tris عند تجزئة هذه العينات الضابطة باستخدام طرق القص الميكانيكي مثل Covaris. استخدام محلول منظم بتركيز Tris أقل من 10 ملي مولار أثناء القص يؤدي إلى تغيير في مقاييس التحويل، وقد لا تكون كفاءات التحويل المُقَيَّمة دقيقة. سؤال: كيف ينبغي تخفيف العينات الضابطة للتطبيقات التي تتضمن التسلسل السطحي؟ ج: بالنسبة للتطبيقات التي يتم فيها التسلسل بعمق أقل من 10 ملايين قراءة مزدوجة، نوصي بتخفيفات التحكم التالية بناءً على كمية العينة المدخلة: 200 نانوغرام: بدون تخفيف لعينات الحمض النووي الضابطة، 10 نانوغرام: تخفيف بنسبة 1:10 لعينات الحمض النووي الضابطة، 1 نانوغرام: تخفيف بنسبة 1:25 لعينات الحمض النووي الضابطة، 0.1 نانوغرام: تخفيف بنسبة 1:25 لعينات الحمض النووي الضابطة. نوصي بوجود 5000 قراءة على الأقل تُطابق جينوم لامدا غير المُمَثْيَل و500 قراءة تُطابق جينوم pUC19 المُمَثْيَل CpG بطول قراءة 76 قاعدة للحصول على تغطية كافية لتحديد كفاءة التحويل بثقة. س: هل يمكن تخزين محلول الحديد (II) المخفف حديثًا لفترة طويلة؟ ج: لا. يجب التخلص من محلول الحديد المخفف حديثًا فور استخدامه.