نيو إنجلاند بيولابس، E8021S، راتنج الأميلوز

راتنج الأميلوز هو مادة تقارب تُستخدم لعزل البروتينات المدمجة مع بروتين ربط المالتوز (MBP). وهو مُصمم للاستخدام في عمود التدفق بالجاذبية. الفئات ذات الصلة: تنقية الأميلوز (علامة MBP)، تنقية التقارب، تطبيقات تنقية البروتين: علامة تقارب MBP، تنقية التقارب وعلامات التعبير. المواصفات: محلول التخزين: 20% إيثانول. سعة الربط: >4 ملغ بروتين اندماجي MBP5*-باراميوسين ΔSal/مل راتنج أميلوز. قابل للتجديد: نعم. الأسئلة الشائعة: س: يمر جزء كبير من بروتين الاندماج الخاص بي عبر عمود الأميلوز. هل هناك أي شيء يمكنني فعله لتحسين تقارب بروتين الاندماج مع عمود الأميلوز؟ ج: قد لا يلتصق بروتين اندماج MBP بعمود الأميلوز بسبب وجود عامل ما في المستخلص يتداخل مع الربط، أو بسبب انخفاض التقارب الذاتي. تشمل العوامل الموجودة في المستخلص الخام والتي قد تتداخل مع الارتباط المنظفات غير الأيونية والمكونات الخلوية التي تُطلق أثناء طرق التحلل البديلة (المعالجة المطولة بالليزوزيم أو المرور المتكرر عبر مكبس فرنسي). بالإضافة إلى ذلك، تحتوي الخلايا النامية في وسط LB وأوساط مشابهة على كميات كبيرة من الأميليز الذي يتداخل مع الارتباط، على الأرجح إما عن طريق قطع البروتين المدمج عن العمود أو عن طريق إطلاق المالتوز الذي يُذيب البروتين المدمج من العمود. بإضافة الجلوكوز إلى الوسط، يتم تثبيط التعبير عن هذا الأميليز، وبالتالي يتم التخفيف من المشكلة. قد يكون انخفاض الألفة الذاتية ناتجًا عن تفاعل بين البروتين المراد دراسته وMBP، مما يؤدي إما إلى حجب موقع ارتباط المالتوز أو تشويهه. على الرغم من أن هذا قد يكون متأصلًا في البروتين المراد دراسته، إلا أنه في بعض الأحيان يمكن التخفيف من المشكلة عن طريق تقصير أو إطالة عديد الببتيد المدمج مع MBP. س: كم مرة يمكنني استخدام عمود الأميليز؟ ج: أهم عامل في تحديد العمر الافتراضي لراتنج الأميلوز هو مدة ملامسته لكميات ضئيلة من الأميليز الموجودة في المستخلص الخام. في الظروف العادية (مستخلص خام من لتر واحد من الخلايا المزروعة في وسط LB مع 0.2% جلوكوز، عمود بحجم 15 مل)، يفقد العمود من 1 إلى 3% من قدرته على الارتباط في كل مرة يُستخدم فيها. إذا كان مردود البروتين المدمج في هذه الظروف 40 ملغ، فهذا يعني أنه بعد 3 إلى 5 دورات، سيحدث انخفاض في المردود. عمليًا، غالبًا ما نستخدم العمود 8 أو 10 مرات قبل أن نلاحظ انخفاضًا ملحوظًا في المردود. س: ما هو المعروف عن الارتباط في وجود المنظفات غير الأيونية؟ ج: بعض البروتينات المدمجة لا ترتبط بكفاءة (أقل من 5% ارتباط) في وجود 0.2% من Triton X-100 أو 0.25% من Tween 20، بينما لا تتأثر بروتينات مدمجة أخرى. بالنسبة لبروتين اندماجي واحد لا يرتبط بمحلول توين 20 بتركيز 0.25%، فإن تخفيف التوين إلى 0.05% يعيد حوالي 80% من الارتباط. س: هل يمكنني استبدال محلول منظم أو تركيز ملح مختلف في محلول العمود؟ ج: نعم، يمكن استخدام محاليل HEPES وMOPS والفوسفات (بقيم أس هيدروجيني تتراوح من 6.5 إلى 8.5) بدلاً من Tris-HCl في محلول العمود مع نتائج مماثلة. كما أن تركيزات كلوريد الصوديوم أو كلوريد البوتاسيوم من 25 ملي مولار إلى 1 مولار متوافقة مع تنقية التقارب. س: أرى بروتين الاندماج سليمًا بواسطة SDS-PAGE عند تشغيل الخلايا المغليّة في محلول العينة، ولكن عند فحص المستخلص الخام، يكون بروتين الاندماج متحللًا. ج: بالنسبة لبروتينات الاندماج المُعبَّر عنها في السيتوبلازم، في كثير من الحالات يحدث معظم التحلل أثناء الحصاد والتحلل. قد يساعد الحصاد الفوري وتحليل الخلايا بسرعة. في حالات أخرى، يحدث التحلل عندما يتعرض البروتين المدمج لبروتيازات الغشاء الخارجي أو الموجودة في الفراغ المحيط بالخلية. وأفضل استراتيجية في كلتا الحالتين هي استخدام كائن مضيف يفتقر إلى البروتياز (البروتيازات) المسببة للتحلل. س: عندما أقوم بتشغيل البروتين المدمج المنقى على هلام SDS-PAGE، لماذا أرى عدة حزم بدلاً من حزمة واحدة بالوزن الجزيئي المتوقع؟ ج: هناك تفسيران محتملان لهذه النتيجة. الأول هو أن البروتين المدمج غير مستقر، مما يؤدي في أغلب الأحيان إلى تحلله داخل الكائن الحي. في هذه الحالة، من المتوقع رؤية حزم بين حجم بروتين MBP (42.5 كيلو دالتون) والحجم المتوقع للبروتين المدمج كامل الطول، لأن الأجزاء الأصغر من MBP لن ترتبط بعمود التقارب. ويُستثنى من ذلك حالة تحلل البروتين المدمج عند نقطة اتصال MBP بالبروتين المراد دراسته، وتكوين البروتين المراد دراسته لتجمعات بروتينية. في هذه الحالة، قد يرتبط البروتين المطلوب بالبروتين المدمج، وبالتالي قد يظهر شريط بحجم البروتين المطلوب حتى لو كان أصغر من MBP. التفسير الثاني هو أن البروتين المطلوب يرتبط بشكل غير نوعي ببروتينات أخرى من الإشريكية القولونية، على سبيل المثال، يمتلك سطحًا يرتبط ببروتينات أخرى عن طريق التفاعلات الكهروستاتيكية أو الكارهة للماء. في هذه الحالة، يمكن أحيانًا استخدام تعديلات على محلول عمود الفصل للمساعدة في إزالة البروتينات المتفاعلة. يمكن إضعاف التفاعلات الكهروستاتيكية بإضافة ما يصل إلى 1 مولار من كلوريد الصوديوم إلى محلول عمود الفصل، ويمكن إضعاف التفاعلات الكارهة للماء بخفض تركيز الملح إلى 25-50 ملي مولار من كلوريد الصوديوم وإضافة 5% من الإيثانول أو الأسيتونيتريل إلى محلول عمود الفصل. يمكن أيضًا استخدام المنظفات غير الأيونية لإضعاف التفاعلات الكارهة للماء، ولكنها قد تؤثر على ألفة بعض البروتينات المدمجة. س: هل يمكنني إجراء تنقية دفعة باستخدام راتنج الأميلوز؟ ج: نعم، التنقية الدفعية فعالة، على الرغم من صعوبة إزالة جميع البروتينات غير النوعية بنفس كفاءة التنقية في العمود نظرًا لحجم الراتنج. يتحمل الراتنج الطرد المركزي حتى 6000 ضعف قوة الجاذبية الأرضية. الحل الأمثل هو تحميل الراتنج دفعة واحدة، عن طريق حضانته مع الرج لمدة ساعتين إلى ليلة كاملة، ثم سكبه في عمود للغسل والإذابة. قد لا يكون تخفيف المستخلص الخام ضروريًا لتحميل العمود بهذه الطريقة. س: هل يتلف راتنج الأميلوز بالتخزين عند -20 درجة مئوية؟ ج: نوصي بتخزين الخرز عند 4 درجات مئوية وعدم تجميده مطلقًا. يتجمد الراتنج عند -20 درجة مئوية، لكن أداءه لا يتأثر بدورة تجميد/ذوبان واحدة. قد يؤدي تجميد المنتج في محلول آخر غير محلول التخزين الخاص بنا (أي في غياب 20% إيثانول) إلى انخفاض أداء الراتنج أو تلفه، لذا يجب على العميل التحقق من الأداء الوظيفي قبل الاستخدام. س: ما هو عمود الفصل بالجاذبية الذي توصون به؟ ج: نوصي باستخدام أعمدة Econo Column من Bio-Rad بقطر داخلي 2.5 سم أو أعمدة Kontes Flex-Column. يمكن تعديل أحجام الأعمدة (القطر الداخلي والطول) حسب كمية الراتنج اللازمة لعزل البروتين المطلوب بكميات كافية. س: هل يمكن تنظيف راتنج الأميلوز وتخزينه وإعادة استخدامه؟ ج: نعم، يمكن إعادة استخدام الراتنج من ثلاث إلى خمس مرات عند تنظيفه وتخزينه باتباع تسلسل الغسل التالي: ماء: 3 أحجام عمود، محلول SDS بتركيز 0.1% في الماء: 3 أحجام عمود، ماء: 3 أحجام عمود، محلول منظم للعمود: 3 أحجام عمود (للاستخدام قصير المدى) أو إيثانول بتركيز 20%: 3 أحجام عمود (للتخزين طويل المدى). نوصي بإجراء عملية التنظيف المذكورة أعلاه في درجة حرارة الغرفة لتجنب ترسب SDS في درجات الحرارة المنخفضة. مع الاستخدام المتكرر لراتنج الأميلوز، يقلل إنزيم الأميليز الموجود في مستخلص الإشريكية القولونية من قدرة العمود على الارتباط. لذا، يُنصح بتنظيف العمود وتخزينه -كما هو موضح أعلاه- فورًا بعد كل استخدام. س: هل يمكن تنقية بروتينات MBP المدمجة في وجود مواد مُفسِّخة مثل اليوريا أو غوانيدين هيدروكلوريد؟ ج: لا، يعتمد انجذاب بروتين MBP للأميلوز والمالتوز على الروابط الهيدروجينية التي بدورها تتحدد مواقعها بواسطة البنية ثلاثية الأبعاد للبروتين. كما أن العوامل التي تُعيق الروابط الهيدروجينية أو بنية البروتين تُعيق الارتباط أيضًا.