نيو إنجلاند بيولابس، E8022L، راتنج الأميلوز عالي التدفق

راتنج الأميلوز عالي التدفق هو مصفوفة تقارب متشابكة تُستخدم لعزل البروتينات المدمجة مع بروتين ربط المالتوز (MBP). يمكن استخدام هذه المصفوفة الصلبة في أنظمة الكروماتوغرافيا الآلية. الفئات ذات الصلة: تنقية الأميلوز (علامة MBP)، تنقية التقارب، تطبيقات تنقية البروتين: علامة تقارب MBP، تنقية التقارب وعلامات التعبير، تنقية البروتين. المواصفات : محلول التخزين: 20% إيثانول. سعة الربط: >4 ملغ بروتين اندماجي MBP5* - باراميوسين δSal / مل راتنج أميلوز عالي التدفق. قابل للتجديد: نعم. الأسئلة الشائعة: س: ما هو عمود الجاذبية الذي توصون به؟ ​​ج: نوصي باستخدام عمود Econo Column من Bio-Rad بقطر داخلي 2.5 سم أو عمود Kontes Flex-Column. يمكن زيادة أو تقليل أحجام الأعمدة (القطر الداخلي والطول) بناءً على كمية الراتنج اللازمة لعزل البروتين المطلوب بكميات كافية. س: يمر جزء كبير من بروتين الاندماج الخاص بي عبر عمود الأميلوز. هل هناك أي شيء يمكنني فعله لتحسين انجذاب بروتين الاندماج لعمود الأميلوز؟ ج: قد لا يلتصق بروتين الاندماج MBP بعمود الأميلوز بسبب وجود عامل ما في المستخلص يعيق الارتباط، أو بسبب انخفاض انجذابه الذاتي. تشمل العوامل الموجودة في المستخلص الخام والتي قد تعيق الارتباط المنظفات غير الأيونية والمكونات الخلوية التي تُطلق أثناء طرق التحلل البديلة (المعالجة المطولة بالليزوزيم أو المرور المتكرر عبر مكبس فرنسي). بالإضافة إلى ذلك، تحتوي الخلايا النامية في وسط LB والأوساط المشابهة على كميات كبيرة من الأميليز الذي يعيق الارتباط، على الأرجح إما عن طريق قطع بروتين الاندماج عن العمود أو عن طريق إطلاق المالتوز الذي يُذيب بروتين الاندماج من العمود. بإضافة الجلوكوز إلى الوسط، يتم تثبيط التعبير عن هذا الأميليز، وبالتالي يتم التخفيف من المشكلة. قد ينتج انخفاض الألفة الذاتية عن تفاعل بين البروتين المستهدف وبروتين ربط المالتوز (MBP) يؤدي إما إلى حجب أو تشويه موقع ارتباط المالتوز. على الرغم من أن هذا قد يكون متأصلًا في البروتين المستهدف، إلا أنه يمكن أحيانًا التخفيف من المشكلة بتقصير أو إطالة سلسلة الببتيد المدمجة مع بروتين ربط المالتوز. س: كم مرة يمكنني استخدام عمود الأميلوز؟ ج: أهم عامل في تحديد العمر الافتراضي لراتنج الأميلوز هو مدة ملامسته لكميات ضئيلة من الأميليز الموجودة في المستخلص الخام. في الظروف العادية (مستخلص خام من لتر واحد من الخلايا المزروعة في وسط LB + 0.2% جلوكوز، عمود سعة 15 مل)، يفقد العمود 1-3% من قدرته على الارتباط الأولية مع كل استخدام. إذا كان مردود البروتين المدمج في هذه الظروف 40 ملغ، فهذا يعني أنه بعد 3 إلى 5 دورات، سيحدث انخفاض في المردود. عمليًا، غالبًا ما نستخدم العمود 8 أو 10 مرات قبل أن نلاحظ انخفاضًا ملحوظًا في المردود. س: ما هي المعلومات المتوفرة حول الارتباط في وجود المنظفات غير الأيونية؟ ج: بعض البروتينات المدمجة لا ترتبط بكفاءة (أقل من 5%) في وجود 0.2% من تريتون X-100 أو 0.25% من توين 20، بينما لا تتأثر بروتينات مدمجة أخرى. بالنسبة لبروتين مدمج لا يرتبط في محلول توين 20 بتركيز 0.25%، فإن تخفيف توين إلى 0.05% يعيد حوالي 80% من الارتباط. س: هل يمكنني استبدال محلول منظم و/أو تركيز ملح مختلف في محلول العمود؟ ج: نعم، يمكن استخدام محاليل HEPES وMOPS والفوسفات (بقيم أس هيدروجيني تتراوح من 6.5 إلى 8.5) بدلاً من Tris-HCl في محلول العمود مع نتائج مماثلة. كما أن تركيزات كلوريد الصوديوم أو كلوريد البوتاسيوم من 25 ملي مولار إلى 1 مولار متوافقة مع تنقية التقارب. س: أرى بروتين الاندماج سليمًا عند تشغيله على هلام SDS-PAGE بعد غلي الخلايا في محلول العينة، ولكن عند فحص المستخلص الخام، أجد أن بروتين الاندماج متحلل. ج: بالنسبة لبروتينات الاندماج المُعبر عنها في السيتوبلازم، يحدث معظم التحلل في كثير من الحالات أثناء الحصاد والتحلل. قد يساعد الحصاد الفوري والتحلل السريع للخلايا. في حالات أخرى، يحدث التحلل عند تعرض بروتين الاندماج لبروتيازات الغشاء الخارجي أو الموجودة في الفراغ المحيط بالخلية. أفضل استراتيجية في كلتا الحالتين هي استخدام خلية مضيفة تفتقر إلى البروتياز (البروتيازات) المُسببة للتحلل. س: عند تشغيل بروتين الاندماج المُنقى على هلام SDS-PAGE، لماذا أرى عدة حزم بدلاً من حزمة واحدة بالوزن الجزيئي المتوقع؟ ج: هناك تفسيران محتملان لهذه النتيجة. الأول هو أن بروتين الاندماج غير مستقر، مما يؤدي غالبًا إلى تحلله داخل الخلية. في هذه الحالة، يُتوقع ظهور حزم بروتينية بحجم يتراوح بين حجم بروتين MBP (42.5 كيلو دالتون) والحجم المتوقع للبروتين المدمج كامل الطول، لأن الأجزاء الأصغر من MBP لا ترتبط بعمود الفصل. ويُستثنى من ذلك حالة تحلل البروتين المدمج عند نقطة اتصاله ببروتين MBP والبروتين المراد دراسته، مما يؤدي إلى تكوّن تجمعات بروتينية. في هذه الحالة، قد يرتبط البروتين المراد دراسته بالبروتين المدمج، وبالتالي قد تظهر حزمة بحجم البروتين المراد دراسته حتى لو كان أصغر من MBP. أما التفسير الثاني فهو أن البروتين المراد دراسته يرتبط بشكل غير نوعي ببروتينات أخرى من بكتيريا الإشريكية القولونية، كأن يكون له سطح يرتبط ببروتينات أخرى عبر تفاعلات كهروستاتيكية أو كارهة للماء. في هذه الحالة، يمكن أحيانًا استخدام تعديلات على محلول الفصل لتسهيل إزالة البروتينات المتفاعلة. يمكن إضعاف التفاعلات الكهروستاتيكية بإضافة ما يصل إلى 1 مولار من كلوريد الصوديوم إلى محلول العمود، بينما يمكن إضعاف التفاعلات الكارهة للماء بخفض تركيز الملح إلى 25-50 ملي مولار من كلوريد الصوديوم وإضافة 5% من الإيثانول أو الأسيتونيتريل إلى محلول العمود. كما يمكن استخدام المنظفات غير الأيونية لإضعاف التفاعلات الكارهة للماء، ولكنها قد تؤثر على ألفة بعض البروتينات المدمجة. س: هل يمكنني إجراء تنقية دفعة باستخدام راتنج الأميلوز؟ ج: نعم، تُجدي التنقية الدفعية نفعًا، على الرغم من صعوبة إزالة جميع البروتينات غير النوعية بنفس فعالية التنقية في العمود نظرًا لحجم الراتنج. يتحمل الراتنج الطرد المركزي حتى 6000 ضعف قوة الجاذبية الأرضية. يُعد تحميل الراتنج دفعة واحدة، عن طريق حضانته مع الرج لمدة ساعتين إلى ليلة كاملة، ثم سكبه في عمود للغسل والإذابة، حلاً وسطًا جيدًا. قد لا يكون تخفيف المستخلص الخام ضروريًا لتحميل العمود بطريقة الدفعة. س: هل يتلف راتنج الأميلوز عند تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية؟ ج: نوصي بتخزين الخرز في درجة حرارة 4 درجات مئوية وعدم تجميده مطلقًا. سيتجمد الراتنج عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، لكن أداءه لن يتأثر بدورة تجميد/ذوبان واحدة. قد يؤدي تجميد المنتج في محلول آخر غير محلول التخزين الخاص بنا (أي في غياب 20% من الإيثانول) إلى انخفاض أداء الراتنج أو تلفه، لذا يجب على العميل التحقق من الأداء الوظيفي قبل الاستخدام. س: ما هو معدل التدفق الموصى به وأقصى ضغط لراتنج الأميلوز عالي التدفق بعد تعبئته في عمود؟ ج: يتميز راتنج الأميلوز عالي التدفق بمعدلات التدفق ومعايير الضغط الموصى بها التالية: من 2.5 إلى 5 مل/دقيقة عند ضغط أقل من 0.1 ميجا باسكال باستخدام محاليل منظمة بنفس لزوجة الماء. س: هل يمكن تنقية بروتينات MBP المدمجة في وجود عوامل مُفسِّخة مثل اليوريا أو غوانيدين هيدروكلوريد؟ ج: لا، يعتمد انجذاب بروتين MBP للأميلوز والمالتوز على الروابط الهيدروجينية التي بدورها تتحدد مواقعها بواسطة البنية ثلاثية الأبعاد للبروتين. كما أن العوامل التي تعيق الروابط الهيدروجينية أو بنية البروتين تعيق عملية الارتباط أيضاً.