نظام استنساخ عرض الببتيدات من شركة نيو إنجلاند بيولابس، E8101S، Ph.D.™

يحتوي نظام استنساخ عرض الببتيدات Ph.D.™ على ناقل M13KE، وهو الناقل الأصلي لمكتبات Ph.D. من NEB. يُستخدم بادئ التمديد M13 المرفق لإنشاء جزيء DNA مزدوج من قليل النوكليوتيدات الاصطناعي الذي يوفره المستخدم، مع أو بدون قواعد عشوائية. يُفضل استخدام نظام العرض لعرض الببتيدات الصغيرة، أي تسلسلات مكونة من 50 حمضًا أمينيًا أو أقل. الفئات ذات الصلة : تطبيقات عرض العاثيات، الأسئلة الشائعة حول عرض العاثيات: س: هل يمكن استنساخ مكتبات cDNA في M13KE؟ ج: بشكل عام، لا يُعد M13 مناسبًا للتعبير عن cDNA، نظرًا لضرورة التعبير ضمن الإطار الصحيح بين التسلسل القائد (اللازم للإفراز) والنهاية الأمينية لبروتين الغلاف pIII أو pVIII. نتيجةً لهذا الشرط، يجب أن يكون الإدخال ضمن إطار القراءة الصحيح من كلا الطرفين (p = 1/9) وألا يحتوي على أي كودونات توقف ضمن الإطار (p = [61/64] n/3، حيث n هو متوسط ​​طول الإدخال بالزوج القاعدي) حتى يتم دمج تسلسل البروتين المقابل بشكل صحيح مع بروتين الغلاف. ينتج عن ذلك عدد ضئيل للغاية من المستنسخات المنتجة في مكتبات m13 cDNA. في المقابل، يُمكن التعبير عن إدخالات cDNA كبروتينات اندماجية مع بروتين الغلاف في الطرف الكربوكسيلي في أنظمة عرض العاثيات T7. س: هل يُمكنني عرض أجزاء الأجسام المضادة أو البروتينات في الطرف الأميني لبروتين غلاف pIII باستخدام M13KE؟ ج: في نظام عرض العاثيات Ph.D.™، تعرض كل نسخة من pIII تسلسل الببتيد المشفر. لهذا السبب، فإن أي إدخال يتداخل مع تجميع جسيمات العاثية أو وظيفة pIII لن يُنتج عاثيات قابلة للحياة. تُستخدم عادةً أنظمة الفاجيميد، حيث يُوفر العاثي المساعد نسخة ثانية من بروتين الغلاف الأصلي، لعرض أجزاء بروتينية على M13. نعتبر أن 25-50 حمضًا أمينيًا هو النطاق الأقصى لهذا النظام. ويعتمد ذلك إلى حد ما على التسلسل والبنية الثانوية. س: ما هي الاختلافات بين عرض pIII و pVIII؟ ج: تعتمد أنظمة عرض العاثيات الخيطية عمومًا على اندماجات الطرف الأميني مع بروتينات الغلاف pIII أو pVIII. يوجد pIII بخمس نسخ لكل فيريون، ويمكن دمجها جميعًا مع ببتيدات قصيرة دون التأثير على قدرة العاثي على العدوى. أما بروتين الغلاف الرئيسي pVIII فيوجد بحوالي 2700 نسخة لكل فيريون، ويمكن دمج حوالي 10% منها بشكل موثوق مع ببتيدات أو بروتينات. نتيجةً لذلك، تتواجد الببتيدات المُعبَّر عنها كبروتينات اندماجية pIII بتكافؤ منخفض (1-5 نسخ لكل فيريون)، بينما تتواجد بروتينات اندماجية pVIII بتكافؤ عالٍ (حوالي 200 نسخة لكل فيريون). يسمح تأثير زيادة الألفة لعرض pVIII عالي التكافؤ باختيار روابط ذات ألفة منخفضة جدًا، بينما يحد عرض pIII منخفض التكافؤ من الاختيار إلى روابط ذات ألفة أعلى. صُمِّم نظام Ph.D.™ لاستنساخ عرض العاثيات لإنتاج بروتينات اندماجية pIII (5 نسخ من الببتيد لكل فيريون). مكتبات NEB الجاهزة هي بتنسيق عرض pIII خماسي التكافؤ. س: هل يأتي نظام Ph.D.™ لاستنساخ عرض العاثيات مزودًا بناقل DNA مزدوج السلاسل؟ ج: نعم، يتم توفير M13KE في شكل RF، أو مزدوج السلاسل، في #E8101S والذي يمكن استخدامه مباشرةً في الهضم الإنزيمي. يمكن الحصول على الحمض النووي M13 أحادي السلسلة عن طريق ترسيب جزيئات العاثية من السائل الطافي للمزارع المصابة باستخدام PEG/NaCl. أما الحمض النووي ثنائي السلسلة فيُستخلص مباشرةً من الخلايا المصابة. ومن المنتجات ذات الصلة عاثية M13KE (#N0316S). يُرجى مراجعة دليل عرض العاثيات Ph.D.™ للاطلاع على بروتوكولات M13 العامة. س: ما نوع السلالة التي أستخدمها مع نظام استنساخ عرض العاثيات Ph.D.™؟ ج: يمكن استخدام أي سلالة قوية من بكتيريا الإشريكية القولونية (E. coli) من النوع F' أو الذكر مع M13. نُفضل استخدام ER2738 (NEB #E4104S) أو NEB Turbo (NEB #C2984). يمكن تحضير الخلايا لتكون مؤهلة أو شراؤها جاهزة. بالنسبة للمكتبات الأكثر تعقيدًا، يجب استخدام خلايا مؤهلة كهربائيًا (فعالية ≥109 متحول لكل ميكروغرام من M13). راجع بروتوكولنا لتحضير الخلايا المؤهلة كهربائيًا في دليل عرض العاثيات Ph.D.™ أو اشترِها من مجموعة خلايا NEB المؤهلة كهربائيًا. س: لقد اتبعت جميع خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها القياسية لعملية الاستنساخ والتحويل الجيني، وما زلتُ غير قادر على الحصول على النسخة المستنسخة المطلوبة في ناقل M13KE؟ ج: تأكد من سلامة تسلسل القائد pIII وتوافقه مع إطار قراءة بروتين الغلاف pIII في تصميمك (راجع أيضًا الأسئلة الشائعة حول الحمض النووي المكمل رقم 1). بافتراض صحة إطار القراءة، قد لا يسمح الإدخال بإنتاج عاثيات قابلة للحياة إما بسبب مشاكل في التصدير إلى الحيز المحيط بالخلية أو وظيفة بروتين الغلاف pIII بعد تجميع العاثية. من المعروف أن الإدخالات الأكبر من 25-50 حمضًا أمينيًا وتلك التي تحتوي على سيستين في الطرف الأميني أو بقايا مشحونة إيجابيًا تُسبب مشاكل. يمكن التحقق من هذه المشاكل عن طريق استنساخ الإدخال في ناقل آخر يحتوي على مواقع KpnI/EagI. على سبيل المثال، حاول استنساخ الإدخال في pMAL pIII (#N8101S) لمعرفة ما إذا كان من الممكن إنتاج اندماج الإدخال مع بروتين MBP وتصديره إلى الحيز المحيط بالخلية. س: أين يمكنني العثور على تسلسل الجينوم الكامل للناقل الأصلي M13KE، المستخدم لاستنساخ مكتبات عرض الببتيدات Ph.D.؟ ج: تحتوي صفحة أداة تسلسلات وخرائط الحمض النووي على تسلسل النيوكليوتيدات بعدة صيغ، بالإضافة إلى خريطة M13KE. ملاحظة: يحتوي NEB #E8101S على حمض نووي M13KE مزدوج السلاسل، المعروف أيضًا باسم الشكل التضاعفي (RF) (20 ميكروغرام).