مختبرات نيو إنجلاند بيولابس، E8111L، مكتبة ببتيدات عرض العاثيات Ph.D.™-12

تحتوي مكتبة ببتيدات عرض العاثيات Ph.D.-12™ على أنبوب واحد من مكتبة العاثيات Ph.D.-12. مكتبة Ph.D.-12 هي مكتبة تركيبية من ببتيدات عشوائية مكونة من 12 حمضًا أمينيًا، مُدمجة مع بروتين غلاف ثانوي (pIII) لعاثية M13. يُعبَّر عن الببتيد المعروض في الطرف الأميني (N-terminus) لبروتين pIII. تتكون المكتبة من حوالي 10 فئات ذات صلة. تطبيقات عرض العاثيات. أسئلة شائعة حول عرض العاثيات. س: أي من المكتبات الثلاث الجاهزة يجب أن أختار؟ ج: قد تحتوي جميع المكتبات الثلاث الجاهزة (Ph.D.-7 وPh.D-12 وPh.D-C7C) على روابط لهدف معين. لا يعتمد اختيار المكتبة على نوع الهدف أو التطبيق اللاحق. لهذا السبب، نوصي معظم العملاء بالبدء بإحدى المكتبتين الخطيتين، Ph.D-7 أو Ph.D-12. يُستثنى من ذلك الحالات التي تتطلب فيها التطبيقات بنية حلقية، وفي هذه الحالة يُوصى باستخدام مكتبة Ph.D.-C7C ذات الحلقات ثنائية الكبريتيد. س: ما هي مكتبات الببتيدات المتاحة للاستخدام مع تقنية Ph.D.™ لعرض العاثيات؟ ج: تُوفر شركة NEB ثلاث مكتبات ببتيدات عشوائية جاهزة، بالإضافة إلى ناقل الاستنساخ M13KE (NEB #E8101S) لإنشاء مكتبات مخصصة. تتكون المكتبات الجاهزة من مكتبات ببتيد سباعي خطي (Ph.D.™-7 Library NEB #E8102L) ومكتبات ببتيد اثني عشري (Ph.D.™-12 Library NEB #E8111L)، بالإضافة إلى مكتبة ببتيد سباعي مقيد بروابط ثنائية الكبريتيد (Ph.D.™-C7C Library NEB #E8121L). Ph.D.™ علامة تجارية مسجلة لشركة نيو إنجلاند بيولابس. س: أستخدم نظام عرض العاثيات Ph.D.™، ولكن تركيز العاثيات المُضخّمة منخفض. ج: لضمان تضخيم عاثية M13 بكفاءة، من الضروري تهوية المزارع جيدًا، وإصابتها في المراحل المبكرة من نموها. نوصي بالتضخيم في مزارع حجمها 20 مل في قوارير إرلنماير سعة 250 مل، مع ضبط جهاز الرج على 250 دورة في الدقيقة. التضخيم في أوعية أصغر، مثل الأنابيب المخروطية سعة 50 مل، سيؤدي إلى انخفاض كبير في كمية العاثيات المُضخّمة. يجب إضافة عاثية M13 إما إلى مزرعة في بداية مرحلة النمو اللوغاريتمي (A600 < 0.01)، أو إلى تخفيف 1:100 من مزرعة ليلية. تصل كمية العاثيات المُضخّمة إلى أقصى حد لها بعد 4.5-5 ساعات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. قد يؤدي إطالة فترة الحضانة إلى حذف أجزاء من الحمض النووي، لذا لا يُنصح بذلك. في حال إجراء عملية استخلاص غير محددة باستخدام محلول جليسين ذي الرقم الهيدروجيني 2.2، يجب معادلة العاثية المستخلصة كما هو موضح في الدليل قبل التضخيم. س: أستخدم جهاز Ph.D.™ لعرض العاثيات، ولا تُنتج قوالب الحمض النووي للعاثيات تسلسلًا قابلًا للقراءة. ج: يجب أن يوفر بروتوكول التنقية السريعة لقوالب الحمض النووي أحادي السلسلة لتفاعلات التسلسل قالبًا أحادي السلسلة بنقاء كافٍ لتفاعلات التسلسل. يجب اتباع الإجراء بدقة كما هو موضح في الدليل: سيؤدي الترسيب المطول بالإيثانول، أو الترسيب عند درجة حرارة 20 درجة مئوية، أو الطرد المركزي لأكثر من 10 دقائق إلى ترسيب مشترك للأملاح وبروتينات العاثية، مما سيمنع التسلسل. بالإضافة إلى ذلك، من الضروري تعليق راسب العاثية جيدًا في محلول اليود قبل إضافة الإيثانول. إذا استمرت المشاكل، أو في حال استخدام طريقة تسلسل أخرى، يمكن إضافة خطوة استخلاص باستخدام الفينول:الكلوروفورم: بعد التعليق في محلول اليود، أضف حجمين من محلول TE، واستخلص مرة واحدة باستخدام الفينول:الكلوروفورم (1:1) ومرة ​​أخرى باستخدام الكلوروفورم، ثم رسّب الناتج باستخدام الإيثانول. 5 ميكرولتر من القالب المعلق (حوالي 0.5 ميكروغرام) تكفي للتسلسل؛ ويجب تأكيد الكمية باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز باستخدام 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي M13 أحادي السلسلة (NEB #N4040S) كمعيار. س: أستخدم Ph.D.™ Phage Display، ولا تظهر قوالب التسلسل في مكانها الصحيح على الهلام. ج: قوالب التسلسل المُحضّرة بالطريقة المذكورة في الدليل أحادية السلسلة (حوالي 7250 نيوكليوتيد)، وبالتالي لن تتطابق مع العلامات ثنائية السلسلة من نفس الطول. سيختلف الحجم الظاهري تبعًا للجهد الكهربائي المُطبق، وتركيز الإيثيديوم والأجاروز في الهلام، ونوع محلول التشغيل المستخدم (TBE أو TAE). نوصي بشدة باستخدام الحمض النووي M13 أحادي السلسلة (مثل M13mp18 أحادي السلسلة، NEB #N4040) كعلامة. س: أستخدم Ph.D.™ Phage Display، وبعد أربع جولات أو أكثر من الفرز، كانت جميع المستنسخات عبارة عن عاثيات من النوع البري (بقع بيضاء). ج: في جولة نموذجية من الفرز الحيوي، يتفاعل حوالي 2 × 10¹¹ عاثية مُدخلة مع الهدف، ويتم استخلاص ما بين 10³ و10⁷ عاثية إجمالًا بعد الغسل. وهذا يُعادل زيادة في التركيز بمقدار 10⁴ إلى 10⁸ ضعف لكل جولة. وبما أن المكتبة تحتوي على حوالي 2 × 10⁹ مستنسخات مختلفة، فمن المفترض نظريًا أن تكون مجموعة العاثيات المستخلصة مُخصبة بالكامل لصالح تسلسلات الارتباط بعد جولتين أو ثلاث جولات فقط. بمجرد الوصول إلى هذه المرحلة، لن تؤدي جولات التضخيم والتصفية الإضافية إلا إلى اختيار العاثيات التي تتمتع بميزة نمو على عاثيات المكتبة. على سبيل المثال، ستطغى مستويات ضئيلة للغاية من عاثيات البيئة البرية الملوثة (أقل من جزء واحد في المليار) على المجموعة تمامًا إذا تم إجراء عدد كبير جدًا من جولات التضخيم، بغض النظر عن قوة الاختيار المختبري. س: عند إجراء تجربة باستخدام تقنية عرض العاثيات Ph.D.™، يشير اختبار ELISA إلى أن ارتباط الخلفية باللوحة مرتفع مثل ارتباطها بالهدف. ج: عند التصفية على لوحة من البوليسترين مطلية بالهدف (طريقة الطلاء المباشر)، من الممكن اختيار ببتيدات ترتبط بشكل خاص بسطح البوليسترين عن غير قصد (انظر Adey, NB et al. (1995) Gene 156, 27-31). ستعطي هذه الببتيدات إشارات ELISA متطابقة في وجود الهدف وغيابه، لأن لوحة ELISA مصنوعة أيضًا من البوليسترين. تتميز هذه "الروابط البلاستيكية" بغناها بالأحماض الأمينية العطرية (فينيل ألانين، تيروسين، تريبتوفان، هيستيدين)، والتي غالبًا ما تتناوب فيما بينها (يُعدّ التسلسل FHWTWYW رابطًا بلاستيكيًا تم اكتشافه وتوصيفه في شركة NEB). غالبًا ما يتم اختيار الروابط البلاستيكية في غياب تفضيل قوي لتسلسلات الببتيدات الموجودة في المكتبة؛ إذ قد تُنتج مكتبات أخرى التسلسلات المطلوبة الخاصة بالهدف. يمكن تجنب اختيار الببتيدات الخاصة بالبوليسترين باستخدام بروتوكول التقاط الخرز الموضح في الدليل. يتفاعل العاثي مع الهدف في المحلول، ثم تُلتقط معقدات العاثي-الهدف على خرز يرتبط بالهدف تحديدًا (بروتين A-أجاروز للأهداف المضادة، غلوتاثيون-أجاروز لبروتينات GST المدمجة، إلخ). يُزال العاثي غير المرتبط بغسل الخرز جيدًا في أنبوب طرد مركزي دقيق. على عكس البوليسترين، من غير المرجح أن تقوم الخرزات (عادةً ما تكون من الأغاروز المتشابك) أو أنبوب الطرد المركزي الصغير (من البولي بروبيلين) بانتقاء تسلسلات ببتيدية محددة من المكتبة، على الرغم من أن الأنواع المرتبطة بالخرزات (البروتين A، والجلوتاثيون، وما إلى ذلك) قد تفعل ذلك. لتجنب انتقاء الروابط الخاصة بالخرزات، نقترح إما التناوب بين جولات مختلفة من الخرزات الخاصة بالهدف (مثل خرزات البروتين A للجولتين 1 و3، وخرزات البروتين G للجولة 2 لأهداف الأجسام المضادة)، أو إضافة خطوة فرز طرحية، تبدأ بالجولة 2، حيث يتم أولاً تفاعل مجموعة العاثيات مع الخرزات وحدها (بدون هدف)، ثم يتم التخلص من الخرزات، ويتم تفاعل الراشح من هذه الخطوة مع الهدف. س: عند استخدام Ph.D.™ Phage Display، أسفرت عملية الفرز عن تسلسل توافقي، ولكن لم تظهر أي إشارة ELISA. ج: عند توصيف مستنسخات العاثيات باستخدام بروتوكول ELISA المذكور في الدليل، يصعب إضافة أكثر من 10¹² فيروس لكل 100 ميكرولتر في البئر. هذا يعادل تركيزًا للعاثيات يبلغ 16 نانومولار فقط. عند هذا التركيز، لا يمكن ملاحظة إشارة ELISA إيجابية واضحة إلا إذا كانت ألفة الارتباط في نطاق الميكرومولار أو أفضل. تسمح الطبيعة التكرارية لاختيار العاثيات بتحديد الروابط ذات نطاق واسع من الألفة، من أقل من نانومولار إلى 1 ملي مولار، لذا لن تُظهر الروابط ذات الألفة المنخفضة إشارة ELISA إيجابية. في هذه الحالة، من الضروري زيادة تركيز الرابط المُختار، إما عن طريق تصنيع ببتيد مطابق للتسلسل المُختار (مع التأكد من تضمين تسلسل الفاصل GGGS في الطرف الكربوكسيلي، وإضافة مجموعة أميد إلى مجموعة الكربوكسيل الطرفية إن أمكن)، أو عن طريق التعبير عن التسلسل المُختار كبروتين اندماجي في الطرف الأميني مع بروتين أصغر. بدلاً من ذلك، يمكن إجراء اختبار ELISA ساندويتش، حيث يتم تثبيت العاثية المختارة وإضافة كمية زائدة من البروتين المستهدف في الطور السائل. يتطلب هذا الإجراء استخدام جسم مضاد ضد البروتين المستهدف، أو أي وسيلة أخرى للكشف عن البروتين المستهدف المرتبط. قم بتغطية الآبار طوال الليل بجسم مضاد مضاد لـ M13 (بدون HRP)، ثم اغسلها، وأضف تخفيفات متسلسلة من كل مستنسخ عاثية (مستنسخ واحد لكل صف). بعد ساعة، اغسل العاثية غير المرتبطة وأضف كمية زائدة من البروتين المستهدف (0.1 - 1 ميكرومول) في محلول TBST. حضّن لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم اغسل البروتين المستهدف غير المرتبط، واكشف عن البروتين المستهدف المرتبط باستخدام جسم مضاد مرتبط بإنزيم. س: أستخدم Ph.D.™ Phage Display، ولم تُنتج تجربة التحكم بالستربتافيدين تسلسل توافق HPQ. ج: إذا استخدمتَ جليسين منخفض الحموضة بدلاً من البيوتين لإذابة العاثية، فمن المحتمل ألا تحصل على تسلسل توافق HPQ. نظرًا لانخفاض ألفة تفاعل الببتيد مع الستربتافيدين، فإن الإذابة غير النوعية غير قادرة على إثراء الببتيدات الحاوية على HPQ بشكل انتقائي. يمكن إذابة هذه الببتيدات تنافسيًا باستخدام البيوتين، وهو الرابط الطبيعي. إذا استخدمت البيوتين للإذابة ولم تحصل على تسلسل توافقي، فمن المرجح أنك لم تقم بعمليات غسل كافية. عند الغسل، اسكب محلول الغسل في الصفيحة من الزجاجة (لا تستخدم الماصة برفق) وحركها لمدة 10 ثوانٍ تقريبًا في كل مرة. يجب أن يتراوح عدد العاثيات التي تُذاب بعد الجولة الأولى من الفرز الحيوي بين 10³ و10⁷ (أقرب إلى 10³ في بئر ELISA وأقرب إلى 10⁷ في الآبار الأكبر). إذا كنت تُذاب عددًا أكبر من العاثيات، فهذا يعني أنك لا تغسل جيدًا، وبالتالي لا تحصل على إثراء كافٍ. قد يُفيد أيضًا إضافة 0.1 ميكروغرام/مل من الستربتافيدين إلى محلول الحجب لتكوين مُركّب مع أي بيوتين مُلوِّث في بروتين مصل الألبومين البقري (BSA)، والذي قد يُشكّل مُركّبًا مع الستربتافيدين على الصفيحة أثناء خطوة الحجب. س: هل يُمكن استخدام سلالة بكتيرية مُختلفة مع نظام عرض العاثيات Ph.D.™؟ ج: نظريًا، يجب أن تعمل سلالات F+ الأخرى التي تحتوي على طفرة كابتة supE (مثل XL1-Blue وDH5αF´) مع نظام عرض العاثيات الخاص بنا. مع ذلك، لم نختبر هذه السلالات مع مكتباتنا، ولا نعلم ما إذا كان سيكون لها أي تأثيرات طفيفة على التعبير عن بعض الببتيدات أو نقلها خارج الخلية. بما أن مكتبات Ph.D. مُصنّعة في سلالة ER2738 (NEB #E4104S)، فنحن نعلم أنه يُمكن التعبير عن جميع الببتيدات في المكتبات بنجاح في هذه السلالة. لذلك، نُوصي بهذه السلالة على أي سلالة أخرى. س: أين يُمكنني العثور على مراجع لمكتبات عرض العاثيات Ph.D.™؟ ج: تُنشر منشورات جديدة باستمرار. ابحث في الأدبيات باستخدام عبارة "عرض الببتيد على العاثيات" مع أو بدون تطبيقك المُختار، وستجد مراجع لمكتباتنا. كما يمكنك الاطلاع على مراجع التطبيقات المُحددة، بالإضافة إلى روابط المنشورات الأساسية هنا. لدينا أيضًا قاعدة بيانات قابلة للبحث تضم أحدث المراجع، يُمكن الوصول إليها من أسفل يمين صفحتنا الرئيسية عبر قسم المنشورات. س: ما هو تسلسل pIII لنسخة مستنسخة بدون إدخال؟ ما الذي يوجد في الطرف الأميني (N-terminus) لنسخة مستنسخة من برنامج الدكتوراه؟ ج: يبدأ إطار القراءة المفتوح لتسلسل gIII الأصلي بـ 5'-GTG AAA AAA TTA … (انظر بداية GTG في مراجعة Kozak, M. (1999) Gene 234, 187-208 بدء الترجمة في بدائيات النوى وحقيقيات النوى؛ van Wezenbeek, PMGF et al (1980) Gene 129-148). يحتوي الطرف الأميني (N-terminus) لـ pIII على تسلسل رائد ضروري لمعالجة البروتين المُترجم حديثًا في الخلية. تم شطر الببتيد الناضج، كما هو معروض على عاثية M13، عند موقع الببتيداز القائد. لاحظ أن المنطقة العشوائية ستكون في نفس إطار القراءة لتسلسل القائد. ترجمة gIII لـ M13KE أو مستنسخ بدون إدخال: MKKLLFAIPLVVPFYSHS // AETVES. ترجمة gIII لمستنسخ PhD (X هو موضع عشوائي): مستنسخ Ph.D.-12 رقم E8210S، E8111L MKKLLFAIPLVVPFYSHS // X12-GGGS-AETVES…pIII→ مستنسخ Ph.D.-7 رقم E8211S MKKLLFAIPLVVPFYSHS // X7-GGGS-AETVES… pIII→ مستنسخ Ph.D.-C7C رقم E8212S MKKLLFAIPLVVPFYSHS // ACX7C-GGGS-AETVES…pIII→ ملاحظة إضافية، مستنسخ Ph.D. سيحتوي المستنسخ على 5 نسخ من نفس بروتين pIII، أي (Ph.D.-7) X7-GGGS-AETVES…، في أحد طرفي الجسيم الأسطواني. // يشير إلى موقع انقسام الببتيداز القائد. س: كيف يتم استنساخ مكتبات عرض العاثيات PhD؟ ج: يوضح الشكل أدناه مخطط الاستنساخ. يرجى الرجوع إلى دليل نظام استنساخ PhD NEB #E8101S للاطلاع على التفاصيل الكاملة. انظر أيضًا: Noren, CJ and Nore, KA 2001 Methods 23, 169-178. doi:10.1006/meth.2000.1118 س: أين يمكنني العثور على تسلسل الجينوم الكامل للناقل الأصلي، M13KE، المستخدم لاستنساخ مكتبات عرض الببتيد Ph.D.؟ ج: تحتوي صفحة أداة تسلسلات وخرائط الحمض النووي على تسلسل النيوكليوتيدات بعدة تنسيقات بالإضافة إلى خريطة M13KE. ملاحظة: يحتوي NEB #E8101S على الحمض النووي المزدوج، المعروف أيضًا باسم الشكل التضاعفي (RF)، M13KE DNA (20 ميكروغرام).