نظام دمج وتنقية بروتين المايلين الأساسي (MBP) من شركة نيو إنجلاند بيولابس، طراز E8201S، NEBExpress®

الفئات ذات الصلة بـ NEBExpress: تنقية الأميلوز (علامة MBP)، نظام دمج وتنقية MBP من NEBExpress، التعبير غير T7، تطبيقات عدم ذوبان البروتين المستهدف، التعبير غير T7، التعبير عن البروتينات الصعبة، الأسئلة الشائعة : س: ما هي السلالات التي توصون بها كمضيفات لناقلات pMAL؟ ج: نوصي باستخدام سلالة E. coli المؤهلة من NEBExpress (NEB #C2523). هذه سلالة من E. coli B مشابهة لـ T7 Express وBL21 (DE3)، باستثناء أنها تفتقر إلى بوليميراز RNA T7 (تستخدم ناقلات pMAL بوليميراز RNA الخاص بـ E. coli). تُعطي سلالات الإشريكية القولونية المؤهلة NEB Express وT7 Express (NEB #C2566) وBL21 (NEB #C2530) وBL21(DE3) (NEB #C2527) نتائج مماثلة، إذ لا يبدو أن وجود بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 له أي تأثير. ومن السلالات الناجحة الأخرى سلالتا الإشريكية القولونية المؤهلة NEB 10-beta (NEB #C3019) وNEB Turbo (NEB #C2984). يُمكن البدء بسلالة NEB Express، أو بأي خلايا مؤهلة متوفرة، ثم تجربة سلالة أخرى في حال ظهور مشكلة في التعبير الجيني أو التنقية. س: ما هي البادئات التي يجب استخدامها لتسلسل نهايات القطعة المُدخلة بعد استنساخها في ناقل pMAL؟ ج: يُمكن استخدام بادئات التسلسل التالية (غير متوفرة من شركة New England Biolabs): بادئة malE على الطرف 5′ للقطعة المُدخلة، وبادئة pMAL العكسية للتسلسل من الطرف 3′. البادئ الأمامي (24 قاعدة، قبل موقع الاستنساخ المتعدد) 5′d(GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC)3′، البادئ العكسي (24 قاعدة، بعد موقع الاستنساخ المتعدد) 5′d(TGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCAC)3′. تتوفر تسلسلات متجهات pMAL أيضًا على الموقع www.neb.com. يمكن إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) للقطع المُدخلة المُستنسخة في موقع الاستنساخ المتعدد باستخدام زوج البادئات نفسه. س: ما هو الحد الأدنى لحجم القطعة التي يمكن استنساخها في pMAL والتعبير عنها مُدمجة مع بروتين MBP؟ هل يمكن إضافة تسلسلات ببتيدية قصيرة (حوالي 10 أحماض أمينية) إلى بروتين MBP؟ ج: يمكن استخدام نظام MBP للتعبير عن الببتيدات القصيرة. مع ذلك، ينتج عن 40 ملغ من بروتين MBP حوالي 1 ملغ من ببتيد مكون من 10 أحماض أمينية (1.1 كيلو دالتون). س: كم مرة يمكنني استخدام عمود الأميلوز؟ ج: أهم عامل في تحديد العمر الافتراضي لراتنج الأميلوز هو مدة ملامسته لكميات ضئيلة من الأميليز الموجودة في المستخلص الخام. في الظروف العادية (مستخلص خام من لتر واحد من الخلايا المزروعة في وسط LB مع 0.2% جلوكوز، عمود بحجم 15 مل)، يفقد العمود من 1 إلى 3% من قدرته على الارتباط في كل مرة يُستخدم فيها. إذا كان مردود البروتين المدمج في هذه الظروف 40 ملغ، فهذا يعني أنه بعد 3 إلى 5 دورات، سيحدث انخفاض في المردود. عمليًا، غالبًا ما نستخدم العمود 8 أو 10 مرات قبل أن نلاحظ انخفاضًا ملحوظًا في المردود. س: هل يمكنني استبدال محلول منظم و/أو تركيز ملح مختلف في محلول العمود؟ ج: نعم، يمكن استخدام محاليل HEPES وMOPS والفوسفات (بقيم أس هيدروجيني تتراوح من 6.5 إلى 8.5) بدلًا من Tris-HCl في محلول العمود مع نتائج مماثلة. تُعدّ تراكيز كلوريد الصوديوم أو كلوريد البوتاسيوم من 25 ملي مولار إلى 1 مولار مناسبةً أيضًا لتنقية الألفة. س: هل يُمكنني إجراء تنقية دفعة باستخدام راتنج الأميلوز؟ ج: نعم، تُجدي التنقية الدفعية نفعًا، على الرغم من صعوبة إزالة جميع البروتينات غير النوعية بكفاءة كما هو الحال في العمود نظرًا لحجم الراتنج. يتحمّل الراتنج الطرد المركزي حتى 6000 ضعف قوة الجاذبية الأرضية. يُعدّ تحميل الراتنج دفعةً واحدةً، عن طريق حضانته مع الرجّ لمدة ساعتين إلى ليلة كاملة، ثم سكبه في عمود للغسل والإذابة، حلاً وسطًا جيدًا. قد لا يكون تخفيف المستخلص الخام ضروريًا لتحميل العمود بالطريقة الدفعية. س: هل يُمكن تنقية بروتينات MBP المدمجة في وجود عوامل مُفسِّخة مثل اليوريا أو غوانيدين هيدروكلوريد؟ ج: لا، تعتمد ألفة بروتين MBP للأميلوز والمالتوز على الروابط الهيدروجينية التي بدورها تتحدد مواقعها بواسطة البنية ثلاثية الأبعاد للبروتين. العوامل التي تتداخل مع الروابط الهيدروجينية أو بنية البروتين تتداخل أيضًا مع عملية الارتباط. س: كيف يمكن إزالة إنزيم TEV Protease من التفاعل بعد عملية الفصل؟ ج: يحتوي إنزيم TEV Protease على علامة بولي هيستيدين في طرفه الأميني، ويمكن إزالته من التفاعل باستخدام كروماتوغرافيا تقارب المعادن المثبتة، مثل خرزات NEBExpress Ni-NTA المغناطيسية (NEB #S1423)، أو أعمدة NEBExpress Ni الدوارة (NEB #S1427)، أو راتنج NEBExpress Ni (NEB #S1428). تتطلب خرزات Ni-NTA المغناطيسية عملية غسيل كلوي لإزالة DTT الموجود في محلول تفاعل إنزيم TEV Protease، بينما يمكن تحميل نواتج هضم إنزيم TEV Protease مباشرةً على أعمدة NEBExpress Ni الدوارة أو راتنج NEBExpress Ni، نظرًا لمقاومة هذين النوعين من الراتنجات كيميائيًا لـ DTT. س: هل يتأثر معدل انشطار بروتياز TEV باليوريا أو هيدروكلوريد الغوانيدين؟ ج: أفاد سي. صن وآخرون بنشاط بروتياز TEV على بروتين اندماجي مع MBP في وجود هذه المواد المُفسِّخة للبروتين، كما يلي: اليوريا: عند تركيز يصل إلى 2 مولار من اليوريا، يُلاحظ انشطار شبه كامل. ويُلاحظ تثبيط طفيف لانشطار بروتياز TEV عند تركيز 4 مولار من اليوريا. هيدروكلوريد الغوانيدين: يُؤدي تركيز 1 مولار من هيدروكلوريد الغوانيدين إلى تثبيط طفيف لانشطار بروتياز TEV؛ ومع ذلك، لا يزال يُلاحظ بعض نشاط بروتياز TEV في وجود تركيز 3 مولار من هيدروكلوريد الغوانيدين. صن، سي. وآخرون (2012) التعبير عن البروتين وتنقيته 82، 226-231. س: كيف يُمكنني فصل MBP وبروتياز TEV عن البروتين المطلوب؟ ج: يحتوي كل من بروتين ربط المالتوز (MBP) وإنزيم بروتياز TEV على علامات متعددة الهيستيدين يمكن استخدامها لإزالتها من البروتين المطلوب. يمكن تحميل ناتج هضم بروتياز TEV مباشرةً على أعمدة NEBExpress Ni Spin (NEB #S1427) أو راتنج NEBExpress Ni (NEB #S1428)، نظرًا لمقاومة هذه الراتنجات كيميائيًا لـ DTT الموجود في محلول تفاعل بروتياز TEV. في حال استخدام خرزات NEBExpress Ni-NTA المغناطيسية (NEB #S1423) أو أي شكل آخر من أشكال كروماتوغرافيا تقارب المعادن المثبتة، نوصي بإجراء غسيل كلوي لناتج هضم بروتياز TEV في محلول متوافق قبل إجراء IMAC. س: أريد إعادة ربط بروتين ربط المالتوز (MBP) بعمود الأميلوز، ولكن يجب إزالة المالتوز. هل يمكن القيام بذلك عن طريق الغسيل الكلوي؟ ج: لا يُعد الغسيل الكلوي فعالًا جدًا في إزالة المالتوز من البروتين الرابط للمالتوز. هذه ظاهرة عامة في تفاعلات البروتين الرابط/الرابط. بعد اختفاء الليجاند الحر، عادةً ما يجد الليجاند المتحرر من موقع الارتباط موقع ارتباط آخر قبل أن يصل إلى غشاء الديال. وقد توصلنا تجريبياً إلى أن ربط البروتين المدمج براتنج كروماتوغرافي ثم غسل المالتوز أكثر فعالية. تُعد الكروماتوغرافيا القياسية (مثل DEAE) خطوة فصل مفضلة، إذ يمكنها فصل بروتياز TEV وMBP عن البروتين المستهدف في حال تعذر استخدام كروماتوغرافيا تقارب المعادن المثبتة. في حال تداخل MBP مع البروتين المستهدف في عملية الفصل، نضيف خطوة غسل بكمية كبيرة لإزالة المالتوز قبل بدء تدرج الملح. بهذه الطريقة، يمكن تمرير الخليط عبر عمود الأميلوز لاحقاً إذا لزم الأمر. بدلاً من ذلك، نوصي باستخدام علامات البولي هيستيدين الموجودة على كل من MBP وبروتياز TEV مع كروماتوغرافيا تقارب المعادن المثبتة لفصلهما عن البروتين المستهدف بعد هضمهما بواسطة بروتياز TEV. س: كيف يُمكنني تخزين البروتين بعد تنقيته؟ ج: يُمكن تخزين معظم البروتينات لبضعة أيام على الأقل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية دون أن تتغير طبيعتها. للتخزين طويل الأمد، يُمكن تجميده عند درجة حرارة -70 درجة مئوية أو غسله بالديال في محلول جلسرين بنسبة 50% وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. عند التخزين عند درجة حرارة -70 درجة مئوية، قسّم البروتين إلى أجزاء صغيرة بحيث لا تحتاج إلا إلى إذابة الجزء المراد استخدامه فقط، لأن دورات التجميد والإذابة المتكررة تُؤدي إلى تغيير طبيعة العديد من البروتينات. س: ما هو MBP6؟ هل يختلف عن MBP الطبيعي المُنتَج من بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: MBP6 هو البروتين المُنتَج من pMAL-c6T والذي يستخدم كودون التوقف الطبيعي الموجود بعد تسلسل التعرف على SbfI. يختلف هذا البروتين عن بروتين MBP الطبيعي بإضافة ميثيونين في الطرف الأميني (كما هو الحال في جميع البروتينات المدمجة في نواقل pMAL-c)، والطفرات التي تزيد من ألفة MBP لراتنج الأميلوز، وحذف آخر أربعة أحماض أمينية من بروتين MBP الطبيعي، وإضافة الأحماض الأمينية المشفرة بواسطة الفاصل وموقع بروتياز TEV. MBP6 عبارة عن مونومر بوزن جزيئي 45.5 كيلو دالتون ونقطة تعادل كهربائي محسوبة 4.9. س: ما هو عمود الفصل بالجاذبية الذي توصون به؟ ​​ج: نوصي باستخدام عمود Econo Column من Bio-Rad بقطر داخلي 2.5 سم أو عمود Kontes Flex-Column. يمكن تعديل أحجام الأعمدة (القطر الداخلي والطول) حسب كمية الراتنج اللازمة لعزل البروتين المطلوب بكميات كافية. س: هل يتلف راتنج الأميلوز عند تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية؟ ج: نوصي بتخزين الخرز عند درجة حرارة 4 درجات مئوية وعدم تجميده مطلقًا. يتجمد الراتنج عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، لكن أداءه لا يتأثر بدورة تجميد/ذوبان واحدة. قد يؤدي تجميد المنتج في محلول آخر غير محلول التخزين الخاص بنا (أي في غياب 20% من الإيثانول) إلى انخفاض أداء الراتنج أو تدهوره، لذا يجب على العميل التحقق من الأداء الوظيفي قبل الاستخدام. س: ما هو المعروف عن الارتباط في وجود المنظفات غير الأيونية؟ ج: لا ترتبط بعض البروتينات المدمجة بكفاءة (أقل من 5% ارتباط) في وجود 0.2% من Triton X-100 أو 0.25% من Tween 20، بينما لا تتأثر بروتينات مدمجة أخرى. بالنسبة لبروتين مدمج واحد لا يرتبط في 0.25% من Tween 20، فإن تخفيف Tween إلى 0.05% يعيد حوالي 80% من الارتباط.