نيو إنجلاند بيولابس، E8211S، مجموعة مكتبة ببتيدات عرض العاثيات Ph.D.-7 الإصدار الثاني

تحتوي مجموعة مكتبة ببتيدات عرض العاثيات Ph.D.-7™ الإصدار الثاني على مكتبة ببتيدات عرض العاثيات Ph.D.-7، وجسم مضاد أحادي النسيلة من الفأر DYKDDDDK، وخرزات مغناطيسية من البروتين G لتجربة تحكم في الفرز، وكمية كافية من بادئ التسلسل -96gIII لأكثر من 50 تفاعل تسلسل. مكتبة ببتيدات عرض العاثيات Ph.D.-7 هي مكتبة تركيبية من ببتيدات عشوائية مكونة من 7 أحماض أمينية مدمجة في الطرف الأميني لبروتين غلاف ثانوي (pIII) لعاثية M13. تتكون المكتبة من حوالي 10 فئات ذات صلة : أدوات البروتين، تطبيقات عرض العاثيات، عرض العاثيات، أدوات تحليل البروتين. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين مجموعات عرض العاثيات الأصلية والإصدار الثاني (v2)؟ ج: تم توضيح الاختلافات الدقيقة بين الإصدار الأصلي ومجموعات الإصدار الثاني (v2) في الجدول أدناه. لم يطرأ أي تغيير على مكتبات Ph.D.-7 وPh.D.-12 وPh.D.-C7C، وظلت أرقام منتجاتها كما هي. تتضمن مجموعات الإصدار الثاني الجديدة تجربة تحكم مبسطة وحديثة للتنقية في المحلول، تتطلب خطوات تجريبية أقل، بينما توصي المجموعات الأصلية بتجربة تنقية سطحية. بالإضافة إلى ذلك، يتم الآن توفير بادئ التسلسل -96 gIII بتركيز أعلى بعشرة أضعاف (10 بيكومول/مل) ليتوافق بشكل أفضل مع إرشادات تقديم البيانات لمرافق التسلسل التجارية. تم حذف بادئ التسلسل -28 gIII لأن موقع التلدين قريب جدًا من المنطقة العشوائية Ph.D. بحيث لا يكون مفيدًا في تقنيات التسلسل الحديثة. مكونات المجموعة الأصلية: الاسم، رقم المنتج، الكمية، التركيز، Ph.D. مكتبة ببتيدات عرض العاثيات E8102 أو E8111 أو E8121 1 × 0.1 مل 1 × 1013 وحدة تشكيل لويحة/مل E. coli K12 ER2738 E4104 1 × 0.2 مل -96 gIII بادئ التسلسل S1259 100 بيكومول 1 بيكومول/مل -28 gIII بادئ التسلسل S1258 100 بيكومول 1 بيكومول/مل ستربتأفيدين N7023 1 × 1.5 ملغ بيوتين N7024 1 × 0.1 مل 10 ملي مول مكونات مجموعة الإصدار الثاني الجديدة الاسم رقم المنتج الكمية التركيز دكتوراه مكتبة ببتيدات عرض العاثيات E8102 أو E8111 أو E8121 1 × 0.1 مل 1 × 1013 وحدة تشكيل لويحة/مل E. coliK12 ER2738 E4104 1 × 0.2 مل -96 gIII بادئ التسلسل S1259 500 بيكومول 10 بيكومول/مل DYKDDDDK جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر E8004 1 × 0.015 مل خرز مغناطيسي بروتين G S1430 1 × 0.15 مل طريقة المجموعة الأصلية طريقة المجموعة الجديدة v2 محلول مسح السطح مسح الطور التقاط سطح البوليسترين (بئر أو طبق بتري) خرز مغناطيسي بروتين G (#S1430) تحضير سطح الالتقاط طلاء الهدف طوال الليل (ستربتافيدين، #N7023)، حجب لمدة ساعتين لا شيء الارتباط (خطوة الاختيار) تطبيق Ph.D. نقل المكتبة إلى السطح المطلي (10-60 دقيقة، درجة حرارة الغرفة). مزج الهدف (DYKDDDDK Mouse mAb، #E8004) مع مكتبة Ph.D. (20 دقيقة، درجة حرارة الغرفة). التقاط معقدات العاثية-الهدف باستخدام خرزات البروتين G المغناطيسية (#S1430). غسل 10 × 1 مل من محلول TBST، ثم سحب أو التخلص من 10 × 1 مل من محلول TBST، ثم الترسيب باستخدام المغناطيس. الإذابة: 1 مل من البيوتين 0.1 ملي مولار (#N7024) (30 دقيقة، درجة حرارة الغرفة). 1 مل من محلول جليسين ذي الرقم الهيدروجيني 2 (10-20 دقيقة، درجة حرارة الغرفة)، ثم معادلة الرقم الهيدروجيني إلى 9 باستخدام TrisHCl. الإثراء في مزرعة الإشريكية القولونية (4-5 ساعات). تكرار عملية الاختيار 1-2 مرات إضافية. دراسات التسلسل و/أو الارتباط (بادئ التسلسل -96 gIII، #S1259). س: أي من المكتبات الثلاث الجاهزة يجب أن أختار؟ ج: قد تحتوي جميع المكتبات الجاهزة الثلاث (Ph.D.-7 وPh.D-12 وPh.D-C7C) على روابط مع هدف محدد. ولا يعتمد اختيار المكتبة على نوع الهدف أو التطبيق اللاحق. لهذا السبب، نوصي معظم العملاء بالبدء بإحدى المكتبتين الخطيتين، Ph.D-7 أو Ph.D-12. ويُستثنى من ذلك الحالات التي تتطلب فيها التطبيقات بنية حلقية، حيث يُوصى باستخدام مكتبة Ph.D.-C7C ذات الحلقات ثنائية الكبريتيد. س: ما الفرق بين المكتبات الجاهزة الثلاث؟ ج: تحتوي المكتبتان الخطيتان Ph.D-7 وPh.D-12 على روابط مع معظم الأهداف. أما بالنسبة للأهداف التي لا تتوافق مع المكتبات الخطية، فقد تحتوي مكتبة Ph.D-C7C ذات الحلقات ثنائية الكبريتيد على روابط مع الهدف المطلوب. تتكون مكتبة Ph.D.-7 من ببتيدات خطية عشوائية مكونة من 7 أحماض أمينية، وقد تكون الأنسب للأهداف التي تتطلب عناصر ربط مركزة في سلسلة قصيرة من الأحماض الأمينية. تتألف مكتبة Ph.D.-12 من ببتيدات خطية عشوائية مكونة من 12 حمضًا أمينيًا. تتميز هذه الببتيدات بتنوع مماثل لمكتبة Ph.D.-7، ولكنها موزعة على نطاق تسلسلي أوسع. تُعد المكتبات ذات القيود البنيوية، مثل مكتبة Ph.D.-C7C، مفيدة بشكل خاص للأهداف التي ترتبط بها الروابط الأصلية ضمن حلقة سطحية، كالأجسام المضادة ذات الحواتم البنيوية. إضافةً إلى ذلك، قد يؤدي فرض قيود بنيوية على الرابط غير المرتبط إلى تقليل إنتروبيا الارتباط غير المواتية، مما يُحسّن طاقة الارتباط الحرة الإجمالية مقارنةً بالروابط غير المقيدة (O'Neil, KT et al 1992 Proteins 14, 509-515). من أبرز عيوب المكتبات ذات البنية المقيدة أن هذا التقييد قد يُعطّل التكوين المطلوب لارتباط الهدف، مما يمنع الارتباط تمامًا بدلًا من تحسين الألفة (McConnell, SJ et al 1994 Gene 151, 115-118). وبغض النظر عن نوع المكتبة، فإن 3-5 مواقع فقط عادةً ما تكون حاسمة للارتباط بالهدف. س: هل يمكن استخدام سلالة بكتيرية مختلفة مع نظام عرض العاثيات Ph.D.™؟ ج: نظريًا، من المفترض أن تعمل سلالات F+ الأخرى التي تحتوي على طفرة كابتة supE (مثل XL1-Blue وDH5αF´) مع نظام عرض العاثيات الخاص بنا. مع ذلك، لم نختبر هذه السلالات مع مكتباتنا، ولا نعلم ما إذا كان سيكون هناك أي تأثيرات طفيفة على التعبير عن بعض الببتيدات أو نقلها خارج الخلية. بما أن مكتبات Ph.D. مصنوعة في سلالة ER2738 (NEB #E4104S)، فنحن نعلم أنه يمكن التعبير عن جميع الببتيدات الموجودة في المكتبات بنجاح في هذه السلالة. لذلك، نوصي بهذه السلالة على أي سلالة أخرى. س: لا تظهر أي لويحات عند معايرة العاثية باستخدام مكتبة عرض العاثيات Ph.D.™. ج: على عكس لامدا، فإن M13 عاثية غير محللة للخلايا ولا تُنتج لويحات واضحة. لويحات M13 هي مناطق ذات نمو خلوي منخفض، وليست تحللًا، وبالتالي قد يصعب رؤيتها. حاول تعريض الطبق للضوء. أيضًا، نظرًا لأن الناقل المستخدم لتحضير المكتبة يحمل جين lacZα، ستكون اللويحات زرقاء اللون، وأسهل في الرؤية، عند استخدام سلالة مكملة ألفا مثل E. coli K12 ER2738 المرفقة وزرعها على أطباق Xgal/IPTG. تأكد أيضًا من أن نطاق التخفيف مناسب للعاثية التي تقوم بمعايرتها. بالنسبة للعاثية المُضخّمة، ضع 10 ميكرولتر من تخفيفات 1:109 - 1:1011. بالنسبة لمستخلصات التصفية غير المضخمة، جرب تخفيفات بنسبة 1:10 إلى 1:104 للجولات الأولى، ومن 1:104 إلى 1:107 للجولات اللاحقة. إذا لم يكن العاثي مخففًا بشكل كافٍ، ستتجمع اللويحات على الطبق، وسيبدو وكأنه لا توجد لويحات على الإطلاق (أو سيظهر لون أزرق خفيف عند استخدام أطباق Xgal). أحيانًا، بعد ترسيب PEG، يتكتل العاثي ولا يخفف بشكل صحيح. نتيجة لذلك، قد يكون لديك طبق يحتوي على عدد كبير جدًا من اللويحات المتداخلة. تأكد من إعطاء العاثي وقتًا كافيًا لإعادة التعليق بعد الترسيب (أكثر من ساعة واحدة)، وقم برج كل أنبوب تخفيف جيدًا (حوالي 10 ثوانٍ). س: أستخدم Ph.D.™ Phage display، وعيار العاثي المضخم منخفض. ج: لضمان تضخيم عاثية M13 بكفاءة، من الضروري تهوية المزارع جيدًا، وإصابتها في المراحل المبكرة من نموها. نوصي بالتضخيم في مزارع حجمها 20 مل في قوارير إرلنماير سعة 250 مل، مع ضبط جهاز الرج على 250 دورة في الدقيقة. التضخيم في أوعية أصغر، مثل الأنابيب المخروطية سعة 50 مل، سيؤدي إلى إنتاجية أقل بكثير من العاثية المُضخّمة. يجب إضافة عاثية M13 إما إلى مزرعة في بداية مرحلة النمو اللوغاريتمي (A600 < 0.01)، أو إلى تخفيف 1:100 من مزرعة ليلية. تصل إنتاجية العاثية المُضخّمة إلى أقصى حد لها بعد 4.5-5 ساعات عند 37 درجة مئوية؛ قد يؤدي الحضانة لفترة أطول إلى حذف أجزاء من الحمض النووي، لذا لا يُنصح بها. في حال إجراء عملية استخلاص غير نوعي باستخدام محلول جليسين ذي الرقم الهيدروجيني 2.2، يجب معادلة العاثية المستخلصة كما هو موضح في الدليل قبل التضخيم. س: أستخدم جهاز Ph.D.™ لعرض العاثيات، ولا تُنتج قوالب الحمض النووي للعاثيات تسلسلًا قابلًا للقراءة. ج: يجب أن يوفر بروتوكول التنقية السريعة لقوالب الحمض النووي أحادي السلسلة لتفاعلات التسلسل قالبًا أحادي السلسلة بنقاء كافٍ لتفاعلات التسلسل. يجب اتباع الإجراء بدقة كما هو موضح في الدليل: سيؤدي الترسيب المطول بالإيثانول، أو الترسيب عند 20 درجة مئوية، أو الطرد المركزي لأكثر من 10 دقائق إلى ترسيب مشترك للأملاح وبروتينات العاثية، مما سيمنع التسلسل. بالإضافة إلى ذلك، من الضروري تعليق راسب العاثية جيدًا في محلول اليود قبل إضافة الإيثانول. إذا استمرت المشاكل، أو في حال استخدام طريقة تسلسل أخرى، يمكن إضافة خطوة استخلاص باستخدام الفينول:الكلوروفورم: بعد التعليق في محلول اليود، أضف حجمين من محلول TE، واستخلص مرة واحدة باستخدام الفينول:الكلوروفورم (1:1) ومرة ​​أخرى باستخدام الكلوروفورم، ثم رسّب الناتج باستخدام الإيثانول. 5 ميكرولتر من القالب المعلق (حوالي 0.5 ميكروغرام) تكفي للتسلسل؛ ويجب تأكيد الكمية باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز باستخدام 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي M13 أحادي السلسلة (NEB #N4040S) كمعيار. س: أستخدم Ph.D.™ Phage Display، ولا تظهر قوالب التسلسل في مكانها الصحيح على الهلام. ج: قوالب التسلسل المُحضّرة بالطريقة المذكورة في الدليل أحادية السلسلة (حوالي 7250 نيوكليوتيد)، وبالتالي لن تتطابق مع العلامات ثنائية السلسلة من نفس الطول. سيختلف الحجم الظاهري تبعًا للجهد الكهربائي المُطبق، وتركيز الإيثيديوم والأجاروز في الهلام، ونوع محلول التشغيل المستخدم (TBE أو TAE). نوصي بشدة باستخدام الحمض النووي M13 أحادي السلسلة (مثل M13mp18 أحادي السلسلة، NEB #N4040) كعلامة. س: أستخدم Ph.D.™ Phage Display، وبعد أربع جولات أو أكثر من الفرز، كانت جميع المستنسخات عبارة عن عاثيات من النوع البري (بقع بيضاء). ج: في جولة نموذجية من الفرز الحيوي، يتفاعل حوالي 2 × 10¹¹ عاثية مُدخلة مع الهدف، ويتم استخلاص ما بين 10³ و10⁷ عاثية إجمالًا بعد الغسل. وهذا يُعادل زيادة في التركيز بمقدار 10⁴ إلى 10⁸ ضعف لكل جولة. وبما أن المكتبة تحتوي على حوالي 2 × 10⁹ مستنسخات مختلفة، فمن المفترض نظريًا أن تكون مجموعة العاثيات المستخلصة مُخصبة بالكامل لصالح تسلسلات الارتباط بعد جولتين أو ثلاث جولات فقط. بمجرد الوصول إلى هذه المرحلة، لن تؤدي جولات التضخيم والتصفية الإضافية إلا إلى اختيار العاثيات التي تتمتع بميزة نمو على عاثيات المكتبة. على سبيل المثال، ستطغى مستويات ضئيلة للغاية من عاثيات النوع البري البيئية الملوثة (أقل من جزء واحد في المليار) تمامًا على المجموعة إذا تم إجراء عدد كبير جدًا من جولات التضخيم، بغض النظر عن قوة الاختيار المختبري. س: عند إجراء تجربة باستخدام تقنية عرض العاثيات Ph.D.™، يشير اختبار ELISA إلى أن الارتباط الخلفي باللوحة مرتفع مثل الارتباط بالهدف. ج: عند التصفية على لوحة من البوليسترين مطلية بالهدف (تصفية الطور السطحي أو الطلاء المباشر للهدف)، من الممكن اختيار ببتيدات ترتبط تحديدًا بسطح البوليسترين عن غير قصد (انظر Adey, NB et al. (1995) Gene 156, 27-31). ستُعطي هذه الببتيدات إشارات ELISA متطابقة في وجود الهدف وغيابه، لأن صفيحة ELISA مصنوعة أيضًا من البوليسترين. عادةً ما تكون هذه "الروابط البلاستيكية" غنية ببقايا عطرية (فينيل ألانين، تيروسين، تريبتوفان، هيستيدين)، والتي غالبًا ما تتناوب (التسلسل FHWTWYW هو رابط بلاستيكي تم اكتشافه وتوصيفه في NEB). غالبًا ما يحدث اختيار الروابط البلاستيكية في غياب تفضيل قوي للهدف لتسلسلات الببتيدات الموجودة في المكتبة: قد تُعطي مكتبات أخرى التسلسلات المطلوبة الخاصة بالهدف. يمكن تجنب اختيار الببتيدات الخاصة بالبوليسترين باستخدام طريقة التصفية في الطور السائل، كلما أمكن ذلك، لهدف معين. يتفاعل العاثي مع الهدف في المحلول، ثم يتم التقاط معقدات العاثي-الهدف على خرزات ترتبط بالهدف بشكل خاص. س: عند استخدام Ph.D.™ Phage Display، أسفرت التصفية عن تسلسل توافقي، ولكن لم تُعطِ أي إشارة ELISA. ج: عند توصيف مستنسخات العاثيات باستخدام بروتوكول ELISA المذكور في الدليل، يصعب إضافة أكثر من 10¹² فيروس لكل 100 ميكرولتر في البئر. هذا يعادل تركيزًا للعاثيات يبلغ 16 نانومولار فقط. عند هذا التركيز، لا يمكن ملاحظة إشارة ELISA إيجابية واضحة إلا إذا كانت ألفة الارتباط في نطاق الميكرومولار أو أفضل. تسمح الطبيعة التكرارية لاختيار العاثيات بتحديد الروابط ذات نطاق واسع من الألفة، من أقل من نانومولار إلى 1 ملي مولار، لذا لن تُظهر الروابط ذات الألفة المنخفضة إشارة ELISA إيجابية. في هذه الحالة، من الضروري زيادة تركيز الرابط المُختار، إما عن طريق تصنيع ببتيد مطابق للتسلسل المُختار (مع التأكد من تضمين تسلسل الفاصل GGGS في الطرف الكربوكسيلي، وإضافة مجموعة أميد إلى مجموعة الكربوكسيل الطرفية إن أمكن)، أو عن طريق التعبير عن التسلسل المُختار كبروتين اندماجي في الطرف الأميني مع بروتين أصغر. بدلاً من ذلك، يمكن إجراء اختبار ELISA ساندويتش، حيث يتم تثبيت العاثية المختارة وإضافة كمية زائدة من البروتين المستهدف في الطور السائل. يتطلب هذا الإجراء استخدام جسم مضاد ضد البروتين المستهدف، أو أي وسيلة أخرى للكشف عن البروتين المستهدف المرتبط. قم بتغطية الآبار طوال الليل بجسم مضاد مضاد لـ M13 (بدون HRP)، ثم اغسلها، وأضف تخفيفات متسلسلة من كل مستنسخ عاثية (مستنسخ واحد لكل صف). بعد ساعة، اغسل العاثية غير المرتبطة وأضف كمية زائدة من البروتين المستهدف (0.1 - 1 ميكرومول) في محلول TBST. حضّن لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم اغسل البروتين المستهدف غير المرتبط، واكشف عن البروتين المستهدف المرتبط باستخدام جسم مضاد مرتبط بإنزيم. س: أين يمكنني العثور على مراجع لمكتبات عرض العاثيات Ph.D.™؟ ج: تُنشر منشورات جديدة باستمرار. ابحث في الأدبيات العلمية باستخدام عبارة "عرض العاثيات الببتيدي" مع أو بدون تطبيقك المختار، وستجد مراجع لمكتباتنا. كما يمكنك الاطلاع على المراجع الخاصة بالتطبيقات المحددة، بالإضافة إلى روابط المنشورات الأساسية هنا. لدينا أيضًا قاعدة بيانات قابلة للبحث تضم أحدث المراجع، ويمكن الوصول إليها من أسفل يمين الصفحة الرئيسية عبر قسم المنشورات. س: ما هو تسلسل pIII لنسخة مستنسخة بدون إدخال؟ وماذا يوجد في الطرف الأميني (N-terminus) لنسخة مستنسخة من برنامج الدكتوراه؟ ج: يبدأ إطار القراءة المفتوح لتسلسل pIII الأصلي بـ 5'-GTG AAA AAA TTA … (انظر بداية GTG في مراجعة Kozak, M. (1999) Gene 234, 187-208 بدء الترجمة في بدائيات النوى وحقيقيات النوى؛ van Wezenbeek, PMGF et al (1980) Gene 129-148). يحتوي الطرف الأميني (N-terminus) لـ pIII على تسلسل قائد ضروري لمعالجة البروتين المترجم حديثًا في الخلية. يتم شطر الببتيد الناضج، كما هو معروض على عاثية M13، عند موقع الببتيداز القائد. ملاحظة: ستكون المنطقة العشوائية في نفس إطار القراءة الخاص بتسلسل القائد. ترجمة gIII لـ M13KE أو مستنسخ بدون إدخال: MKKLLFAIPLVVPFYSHS // AETVES. ترجمة gIII لمستنسخ PhD (X هو موضع عشوائي): مستنسخ Ph.D.-12 رقم E8210S، E8111L MKKLLFAIPLVVPFYSHS // X12-GGGS-AETVES…pIII→ مستنسخ Ph.D.-7 رقم E8211S MKKLLFAIPLVVPFYSHS // X7-GGGS-AETVES… pIII→ مستنسخ Ph.D.-C7C رقم E8212S MKKLLFAIPLVVPFYSHS // ACX7C-GGGS-AETVES…pIII→ ملاحظة إضافية، مستنسخ Ph.D. سيحتوي المستنسخ على 5 نسخ من نفس بروتين pIII، أي (Ph.D.-7) X7-GGGS-AETVES…، في أحد طرفي الجسيم الأسطواني. // يشير إلى موقع انقسام الببتيداز القائد. س: كيف يتم استنساخ مكتبات عرض العاثيات PhD؟ ج: يوضح الشكل أدناه مخطط الاستنساخ. يرجى الرجوع إلى دليل نظام استنساخ PhD NEB #E8101S للاطلاع على التفاصيل الكاملة. انظر أيضًا: Noren, CJ and Nore, KA 2001 Methods 23, 169-178. doi:10.1006/meth.2000.1118 س: أين يمكنني العثور على تسلسل الجينوم الكامل للناقل الأصلي، M13KE، المستخدم لاستنساخ مكتبات عرض الببتيد Ph.D.؟ ج: تحتوي صفحة أداة تسلسلات وخرائط الحمض النووي على تسلسل النيوكليوتيدات بعدة تنسيقات بالإضافة إلى خريطة M13KE. ملاحظة: يحتوي NEB #E8101S على الحمض النووي M13KE مزدوج السلسلة، والمعروف أيضًا باسم الشكل التضاعفي (RF) (20 ميكروغرام).