نيو إنجلاند بيولابس، E9642S، وحدة بادئ NEBNext® RSV

فئات ذات صلة بـ NEBNext: تسلسل الفيروس المخلوي التنفسي (RSV)، الأمراض المعدية وتطبيقات تسلسل ARTIC، بوليميرازات لإعداد مكتبة NGS، الأسئلة الشائعة : س: ما هي الكواشف الإضافية المطلوبة لتخليق وتضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام وحدة NEBNext RSV Primer (NEB #E9642)؟ ج: توصي NEB باستخدام وحدة NEBNext RSV Primer مع مجموعة LunaScript® Multiplex One-Step RT-PCR (NEB #E1555). يمكن الاطلاع على بروتوكول استخدام هذه الكواشف لتوليد مضخمات RSV هنا. س: هل تسلسلات بادئات NEBNext RSV (NEB #E9642) متوفرة؟ ج: نعم، يمكن العثور على تسلسلات بادئات NEBNext RSV هنا: https://github.com/nebiolabs/rsvab-sequencing. س: ما هي سلالات الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) التي يمكن استهدافها باستخدام بادئات NEBNext RSV (NEB #E9642)؟ ج: تستهدف مزيجات بادئات NEBNext RSV الموجودة في وحدة NEBNext RSV Primer Module سلالتي RSV A وRSV B، وذلك من خلال الارتباط بمناطق محفوظة بينهما، بالإضافة إلى مناطق خاصة بكل سلالة. س: هل من الممكن استهداف سلالة RSV A أو RSV B فقط باستخدام مزيجات البادئات الموجودة في وحدة NEBNext RSV Primer Module (NEB #E9642)؟ ج: لا، يحتوي كلا مزيجَي البادئات المُضمَّنَين في وحدة NEBNext RSV Primer Module على بعض أزواج البادئات التي تستهدف كلاً من RSV A وRSV B. س: ما هي كواشف وبروتوكولات تحضير المكتبة التي يُمكن استخدامها لتسلسل المُضخَّمات المُنتَجة باستخدام وحدة NEBNext RSV Primer Module (NEB #E9642)؟ ج: المُضخَّمات المُنتَجة باستخدام وحدة NEBNext RSV Primer Module مُستقلة عن منصة التسلسل. ومع ذلك، نظرًا لأن طول المُضخَّمات يتراوح من 400 إلى 1400 زوج قاعدي، فقد يكون تجزئة الحمض النووي التكميلي (cDNA) ضروريًا لأساليب التسلسل ذات القراءة القصيرة. للتسلسل على منصات Illumina، توصي NEB باستخدام وحدة NEBNext RSV Primer Module مع مجموعة NEBNext UltraExpress® FS DNA Library Prep Kit (NEB #E3340). يمكن الاطلاع هنا على بروتوكول (القسم 2) لاستخدام هذه الكواشف في تسلسل تضخيم RSV. كما يمكن الاطلاع هنا على البروتوكول (القسم 3، الصفحة 11) والكواشف اللازمة لتسلسل تضخيم NEBNext RSV على منصات Oxford Nanopore Technologies. س: هل هناك نطاق مُوصى به لقيمة Ct لمدخلات RSV؟ ج: توصي NEB بمدخلات لا تقل عن 1000 نسخة جينومية. ونظرًا لاختلاف قيم Ct باختلاف نوع التحليل والجينوم المستهدف، فليس لدينا نطاق مُحدد لقيمة Ct. مع ذلك، وكما هو موضح في الشكل أدناه، يُظهر تسلسل العينات السريرية بقيم Ct أقل من 30 في تحليل BioFire® تغطية جينومية عالية. يُرجى الرجوع إلى الشكل 8 في صفحة المنتج للاطلاع على البيانات المُستخرجة من العينات السريرية. س: ما هو الحد الأدنى لعمق القراءة المطلوب عند استخدام وحدة NEBNext RSV Primer Module (NEB #E9642)؟ ج: توصي شركة NEB بحد أدنى لعمق القراءة يبلغ 0.5 مليون قراءة PE لكل مكتبة لتسلسل Illumina. أما بالنسبة لتسلسل ONT على خلية تدفق MinION، فتوصي NEB بحد أدنى لعمق القراءة يبلغ 50,000 قراءة لكل مكتبة. س: ما أنواع العينات المدعومة عند استخدام وحدة NEBNext RSV Primer Module (NEB #E9642)؟ ج: تم التحقق من صحة البروتوكولات المقدمة باستخدام قوالب gRNA عالية الجودة متوفرة تجاريًا. تشمل أنواع العينات الإضافية التي تم اختبارها عزلات RNA من مزارع الخلايا وRNA المستخلص من العينات السريرية (مثل مسحات البلعوم الأنفي) (البيانات موضحة في الشكل 8 على صفحة المنتج). س: ما طرق الاستخلاص التي يمكن استخدامها لعزل RSV gRNA قبل RT-PCR؟ ج: يمكن استخدام RNA المعزول باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الفيروسي/RNA من NEB Monarch® Mag (NEB #T4010S) ومجموعة Monarch Total RNA Miniprep Kit (NEB #T2010). يمكن أيضًا استخدام طرق أخرى لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام الخرز أو الأعمدة. س: هل توجد توصيات لتنظيف مُضخّمات فيروس RSV قبل تحضير المكتبة عند استخدام وحدة NEBNext RSV Primer Module (NEB #E9642)؟ ج: تستخدم بروتوكولات تحضير المكتبة المرفقة لتسلسل مُضخّمات NEBNext RSV مُضخّمات RSV مُخففة كمدخلات لتحضير المكتبة. مع ذلك، إذا كان تنظيف الحمض النووي التكميلي (cDNA) للمُضخّم مُفضّلاً، يُوصى بالتنظيف بتركيز 0.8X باستخدام خرز SPRIselect أو AMPure. على سبيل المثال، إذا كان حجم الحمض النووي التكميلي للمُضخّم 25 ميكرولتر، فسيتم استخدام 20 ميكرولتر (0.8X) من خرز SPRIselect/AMPure لربط الحمض النووي التكميلي، متبوعًا بغسلتين باستخدام 200 ميكرولتر من الإيثانول بتركيز 80%، ثم الإذابة في 15-30 ميكرولتر من الماء. س: هل توجد توصيات محددة لكمية مُضخّمات الحمض النووي التكميلي (cDNA) لفيروس RSV (بعد استخدام وحدة NEBNext RSV Primer Module (NEB #E9642)) لتفاعلات تحضير النهايات بتقنية Oxford Nanopore Technologies، سواءً لتحضير مكتبات ذات تعدد تسلسل منخفض أو عالي؟ ج: توصي NEB باستخدام 6 رموز شريطية أصلية من ONT كحد أدنى لكل عملية تسلسل. بالنسبة للعمليات التي تستخدم من 6 إلى 12 رمزًا شريطيًا، نوصي باستخدام 350 نانوغرام من المُضخّمات ضمن نطاق حجم 400-1400 زوج قاعدي لكل عينة في تفاعل تحضير النهايات لتحضير مكتبة ONT. في حال استخدام أكثر من 48 رمزًا شريطيًا، يمكن استخدام 20-40 نانوغرام من المُضخّمات ضمن نطاق حجم 400-1400 زوج قاعدي لكل عينة كمدخل لتفاعل تحضير النهايات لتحضير مكتبة ONT. س: هل يُمكنني تقليل ربط الباركود غير المُحدد بين العينات المُجمّعة، بعد استخدام وحدة NEBNext RSV Primer Module (NEB #E9642)؟ ج: نعم، أضف 2 ميكرولتر من بروتينيز K الحراري (NEB #P8111S) إلى كل عينة بعد تفاعل ربط الباركود ONT، ثم حضّنها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد معالجة بروتينيز K الحراري، أضف 2 ميكرولتر من EDTA المُرفق في مجموعة Oxford Nanopore Technologies Native Barcoding V14 Kit(s) إلى كل عينة مُرمّزة، ثم تابع عملية التجميع وتنظيف مجموعة العينات المُرمّزة.