نيو إنجلاند بيولابس، G8024L، نيوكلياز NEBExpress® النشط بالملح، درجة GMP

الفئات ذات الصلة: أدوات البروتين، إنزيمات تعديل الحمض النووي وتقنيات الاستنساخ. التطبيقات: تنقية البروتين، أدوات تحليل البروتين، مواصفات التعبير البروتيني. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لتحرير 32 بيكومول من FAM من أوليغونوكليوتيد دبوس الشعر الموسوم بـ FAM-BHQ1 في دقيقة واحدة عند 25 درجة مئوية في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر في محلول مكون من 25 ملي مولار Tris-HCl، و500 ملي مولار NaCl، و5 ملي مولار MgCl2، و0.005% Tween 20 (الأس الهيدروجيني 8.5 عند 25 درجة مئوية). محلول التخزين: 25 ملي مولار Tris-HCl، 500 ملي مولار NaCl، 5 ملي مولار MgCl2، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: أرى أن شركة NEB تقدم إصدارين من NEBExpress® Salt Active Nuclease. ما الفرق بين إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease (NEB #M0764) وإنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease، المُصنّف وفقًا لمعايير التصنيع الجيد (NEB #G8024)؟ ج: يُصنّع إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease، المُصنّف وفقًا لمعايير التصنيع الجيد (GMP) الخاصة بشركة New England Biolabs*، وذلك لتلبية متطلبات توثيق الجودة الصارمة واحتياجات التصنيع، ويتضمن اختبارات إضافية مثل اختبار السموم الداخلية واختبار الحمل الميكروبي. كلا الإنزيمين متطابقان من الناحية الإنزيمية ومُصاغان في نفس المحلول المنظم. مع ذلك، يُقدّم إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease، المُصنّف وفقًا لمعايير التصنيع الجيد (NEB #G8024) بتركيز أعلى بعشرة أضعاف، أي 1,000,000 وحدة/مل (1 ملغم/مل)، لتقليل تخفيف مزرعة الخلايا/العينة مقارنةً بإنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease (NEB #M0764) المُقدّم بتركيز 100,000 وحدة/مل. س: هل يُمكنني طلب إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease، بدرجة GMP (NEB #G8024) بحجم أكبر أو بتركيز مختلف؟ ج: نعم. لطلب إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease، بدرجة GMP (NEB #G8024) بحجم أكبر أو بتنسيق مُخصّص، يُرجى التواصل مع فريق الحلول المُخصّصة لدينا. س: ما هي فوائد العمل في محلول ملحي عالي التركيز؟ ج: يُتيح إجراء عملية التنقية في محلول ملحي عالي التركيز (≥ 200 ملي مولار من كلوريد الصوديوم) فصل الشوائب (الأحماض النووية) عن البروتينات أو الفيروسات عن طريق تعطيل التفاعلات الكهروستاتيكية بين هذه الجزيئات. كما يُمكن أن يُحسّن التركيز العالي للملح من ذوبان البروتين عندما يكون التجمّع ناتجًا عن التفاعلات الكهروستاتيكية. لهذه الأسباب، تتطلب العديد من طرق المعالجة الحيوية استخدام تركيز عالٍ من الملح. يُمكن استخدام إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease مباشرةً في هذه الظروف للتخفيف من تحديات اللزوجة العالية، وتقليل الضغط العكسي، و/أو إزالة الأحماض النووية. س: هل يتمتع إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease بنفس كفاءة إنزيم Serratia marcescens nuclease؟ ج: لا. إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease أكثر نشاطًا (حوالي 4 أضعاف، عند معايرة التركيز نفسه) من إنزيم Serratia marcescens nuclease على الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA عند استخدامه في محلول منظم يحتوي على NaCl/KCl ≥ 300 ملي مولار. س: كيف تتم مقارنة تعريف وحدة إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease مع النيوكليازات الأخرى المماثلة النشطة بالملح؟ ج: على الرغم من اختلاف ظروف اختبار تعريف وحدة إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease (درجة الحرارة، الركيزة، والمحلول المنظم) عن النيوكليازات الأخرى المماثلة المتوفرة في السوق، إلا أننا نقدر أن إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease أكثر نشاطًا بمرتين تقريبًا مقارنةً بالنيوكليازات الأخرى النشطة بالملح. وللتحويل من نيوكلياز ملحي آخر إلى إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease، نوصي بإجراء اختبار استبدال بنسبة 1:1 بناءً على الوحدات. س: هل يمكنني استخدام إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease في محلول ملحي منخفض التركيز؟ ج: نعم. يحتفظ إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease بنسبة 60% من نشاطه عند تركيز 250 ملي مولار من كلوريد الصوديوم أو كلوريد البوتاسيوم، وبنسبة 15% عند غياب الملح. اعتمادًا على التطبيق (تقليل اللزوجة، أو التحلل الجزئي أو الكامل للأحماض النووية)، قد يلزم زيادة تركيز الإنزيم ووقت الحضانة عند استخدام محلول ملحي منخفض التركيز. س: هل يتوافق إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease مع أعمدة التقارب مثل IMAC؟ ج: إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease غير موسوم، ويمكن استخدامه لتنقية البروتينات الموسومة، مثل البروتين الموسوم بالهيستيدين، باستخدام IMAC. س: هل يمكنني إزالة إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease من العينة؟ ج: نعم. يرتبط إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease بقوة بعمود التبادل الكاتيوني نظرًا لارتفاع قيمة pI الخاصة به، وبالتالي، يمكن إزالته بسهولة عن طريق تثبيته على راتنج التبادل الكاتيوني (يوصى باستخدام راتنجات Source 30S أو SP HP أو POROS 50HS). س: كيف يمكنني تعطيل إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease بعد الاستخدام؟ ج: يمكن تعطيل إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease بإحدى الطرق التالية: التعطيل الحراري: يُحضن عند 65 درجة مئوية لمدة ساعتين، أو عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة، أو عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. التعطيل الكيميائي: يُضاف أكثر من 10 ملي مولار من EDTA، أو 0.5% من SDS، أو أكثر من 20 ملي مولار من TCEP. التعطيل الكيميائي والحراري: يُضاف 1 ملي مولار من DTT ويُحضن عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. التحلل الأنزيمي: أضف بروتينيز K (NEB #P8107S) أو بروتينيز K غير المستقر حراريًا (NEB #P8111S). س: ما الفرق بين NEBExpress® Salt Active Nuclease وDNase I-XT (NEB #M0570)؟ ج: يُحلل NEBExpress Salt Active Nuclease الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA، بينما يُحلل DNase I-XT الحمض النووي DNA فقط. وهو فعال بين تركيز ملحي من 0 إلى 1000 ملي مولار (التركيز الأمثل 500 ملي مولار)، بينما صُمم DNase-I XT ليكون فعالًا بين تركيز ملحي من 0 إلى 300 ملي مولار. علاوة على ذلك، يمكن إزالة NEBExpress Salt Active Nuclease بسهولة في عمود واحد نظرًا لارتباطه الفعال جدًا براتنج التبادل الكاتيوني. س: ما الوزن الجزيئي لـ NEBExpress® Salt Active Nuclease؟ ج: يبلغ الوزن الجزيئي لـ NEBExpress Salt Active Nuclease حوالي 25 كيلو دالتون. س: هل إنزيم NEBExpress® Salt Active Nuclease مُغلْيكوزيل؟ ج: لا. يتم إنتاج إنزيم NEBExpress Salt Active Nuclease من بكتيريا الإشريكية القولونية، وبالتالي فهو غير مُغلْيكوزيل، ويظهر على شكل حزمة واحدة عند حوالي 25 كيلو دالتون على هلام البروتين.