نيو إنجلاند بيولابس، L4401S، مزيج LyoPrime WarmStart® الفلوري LAMP/RT-LAMP (مع UDG)

الفئات ذات الصلة: تطبيقات التضخيم متساوي الحرارة وإزاحة السلسلة، التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة، الأسئلة الشائعة حول التضخيم متساوي الحرارة: س: ما هي درجة الحرارة المثلى لتضخيم LAMP/RT-LAMP؟ ج: نوصي بـ 65 درجة مئوية كدرجة حرارة ابتدائية لـ LAMP. ومع ذلك، من الممكن إجراء تفاعلات LAMP وRT-LAMP عند درجات حرارة تتراوح بين 55 و70 درجة مئوية، وذلك حسب طبيعة مجموعة البادئات والأهداف. س: ما هو تركيز أيونات المغنيسيوم (Mg++) في مزيج WarmStart® LAMP/RT-LAMP الرئيسي؟ ج: يحتوي المزيج الرئيسي بتركيز 2X على 16 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)، وبالتالي 8 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم في التفاعل النهائي بتركيز 1X. س: ما هي أنواع عينات/مواد الإدخال المتوافقة مع مخاليط LAMP/RT-LAMP؟ ج: تُعد تقنية LAMP عادةً تقنية قوية ومقاومة للمثبطات، ومزيج WarmStart® LAMP/RT-LAMP الرئيسي قادر على التضخيم المباشر باستخدام مجموعة متنوعة من أنواع العينات. للحصول على أعلى دقة وحساسية، نوصي باستخدام حمض نووي نقي كمدخل. معظم طرق تنقية القوالب الروتينية كافية، مثل مجموعات استخلاص الأحماض النووية Monarch®. نقترح استخدام 2 ميكرولتر من الحمض النووي المستخلص لتفاعل LAMP بحجم 25 ميكرولتر. يمكن استخدام أحجام عينات أكبر أو أصغر. يجب ألا يتجاوز حجم العينات في وسط النقل (VTM أو UTM) 2 ميكرولتر (8% حجم/حجم). س: ما هي سرعة ظهور النتيجة المتوقعة؟ ج: يختلف تضخيم الهدف تبعًا لعدة عوامل، بما في ذلك تصميم البادئات (نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات LAMP من NEB)، ونقاء القالب وكميته. نقترح البدء بفترة حضانة 30 دقيقة. يمكن تقصير هذه الفترة إلى 15-20 دقيقة مع المقايسات المُحسّنة أو الأهداف ذات النسخ العالية، إذا لزم الأمر. بدلاً من ذلك، يمكن إطالتها إلى 60 دقيقة في حالة المدخلات المنخفضة، أو العينات غير النقية، أو المقايسات الأبطأ. لاحظ أنه عند تمديد وقت التفاعل، يجب أيضًا مراقبة عينات التحكم السلبية (NTCs) للتأكد من عدم وجود نتائج إيجابية خاطئة. س: كيف أتأكد من النتيجة الإيجابية؟ ج: تُنتج تفاعلات LAMP سلسلة من السلاسل المتكررة التي تحتوي على التسلسل المستهدف، وتختلف في الحجم. ولأن مُضخّمات LAMP تحتوي على تكرارات لنفس تسلسل الحمض النووي، فإنها عادةً ما تمتلك درجة انصهار فريدة تُؤكد تضخيم الهدف الصحيح. في حال استخدام التألق في الوقت الحقيقي، يُمكن تضمين منحنى الانصهار أو التمسخ بعد حضانة LAMP. لمزيد من المعلومات، راجع قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها في دليل مجموعة WarmStart LAMP. س: هل يُمكنني تحضير تفاعلات LAMP/RT-LAMP في درجة حرارة الغرفة؟ ج: نعم - إنزيمات بوليميراز الحمض النووي Bst وإنزيم النسخ العكسي المستخدمة في هذا المزيج الرئيسي هي تركيبات WarmStart®، لذا فهي مُثبّطة بواسطة الأبتاميرات المُعدّلة في درجة حرارة الغرفة. وبناءً على ذلك، يُمكن تحضير التفاعلات في درجة حرارة الغرفة دون التأثير بشكل كبير على نشاط LAMP. للحصول على معلومات إضافية حول تعديل نشاط الإنزيم في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأبتاميرات، يُرجى الاطلاع على "استخدام الأبتاميرات للتحكم في أنشطة الإنزيم: بدء تشغيل Taq الساخن وما بعده". س: يحتوي مزيج WarmStart LAMP Master Mix على بعض الرواسب في الأنبوب بعد إذابته، هل هذا طبيعي؟ ج: نعم، يُعد ترسب مزيج LAMP Master Mix بعد التجميد/الإذابة أمرًا طبيعيًا. من المهم إعادة تعليق المزيج عن طريق الخلط جيدًا أو استخدام جهاز الخلط الدوامي لإذابة جميع الرواسب، ولكن بعد التعليق، يمكن استخدام مزيج Master Mix كالمعتاد. س: كيف أصمم بادئات LAMP؟ ج: قد يكون تصميم بادئات LAMP يدويًا أمرًا صعبًا، ونوصي بشدة باستخدام برامج متخصصة لسهولة التصميم وزيادة احتمالية نجاح التفاعل. نوصي باستخدام أداة تصميم بادئات LAMP من NEB. نظرًا لأن الأداء ومستويات التضخيم غير المعتمد على القالب قد تختلف حتى مع التصميم الحاسوبي، نوصي بتقييم 2-4 مجموعات كاملة من بادئات LAMP للحصول على الحساسية والنوعية الأمثل قبل اختيار المجموعة النهائية. للحصول على نظرة عامة حول كيفية تصميم واستخدام بادئات LAMP، يُرجى مشاهدة البرنامج التعليمي الخاص بأداة تصميم بادئات LAMP، وقراءة هذه الملاحظة التطبيقية لمزيد من التفاصيل. س: هل يُمكّن مزيج WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) من منع التلوث/تقليل التلوث المتبقي؟ ج: نعم، تم تركيب مزيج WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (مع UDG) بمزيج من dTTP وdUTP. وهذا يضمن تضخيمًا متساوي الحرارة فعالًا بالإضافة إلى دمج dU في نواتج التفاعل. يحتوي المزيج أيضًا على UDG غير مستقر حراريًا في القطب الجنوبي (NEB #M0372). تعمل نواتج LAMP التي تحتوي على dU كركيزة لإنزيم يوراسيل دي إن إيه جليكوزيلاز، مما يسمح بمنع التلوث المتبقي. يجب تحضير التفاعلات في درجة حرارة الغرفة (عادةً 22-25 درجة مئوية) قبل الحضانة متساوية الحرارة للسماح بتحلل نواتج التضخيم المحتوية على dU، أو إذا رغبتم، يمكنكم حضانتها لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية قبل إضافة تفاعل LAMP إلى سير العمل. ولأن تفاعل LAMP يُنتج كميات كبيرة من الحمض النووي في فترات زمنية قصيرة جدًا، فإن أفضل الممارسات لتقليل التلوث تتضمن عدم فتح تفاعلات LAMP بعد التضخيم. س: حدث تضخيم في عينة (عينات) التحكم السلبية (NTC) بعد الحضانة متساوية الحرارة. ما السبب؟ ج: قد يشير التضخيم في عينة التحكم السلبية (بدون قالب) خلال 30 دقيقة إلى تلوث متبادل أثناء تحضير التفاعل أو إلى مشكلة عامة. بعض مجموعات البادئات أكثر عرضة للتضخيم غير النوعي من غيرها. نوصي بتقييم مجموعتين على الأقل من بادئات LAMP لأي هدف محدد. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض صيغ التفاعل أو إجراءات العمل أكثر عرضةً للتضخيم غير النوعي مع مجموعات بادئات معينة، مثل: أحجام التفاعل الكبيرة في أوعية صغيرة (مثل 20 ميكرولتر في صفائح 384 بئرًا)، ودرجات حرارة التفاعل المنخفضة (مثل 60 درجة مئوية بدلًا من 65 درجة مئوية). عند استخدام جهاز التدوير الحراري في الوقت الحقيقي، يمكن تضمين منحنى الذوبان أو التمسخ بعد حضانة LAMP للتمييز بين التضخيم الزائف والتلوث المتبادل، حيث أن كل ناتج تضخيم LAMP سينتج عنه منحنى ذوبان فريد. إذا كانت نتيجة تفاعل NTC إيجابية عند إعادة الاختبار و/أو تغيير إجراءات العمل، فاستبدل جميع مخزونات الكواشف ونظف مساحة العمل بمطهر سطحي مناسب، مثل مبيض بنسبة 10% (تخفيف 1:10 من هيبوكلوريت الصوديوم التجاري بتركيز 5.25-6.0%). س: هل هناك حاجة إلى خطوة حضانة منفصلة لـ RT-LAMP؟ ج: لا داعي لخطوة النسخ العكسي المنفصلة لإجراء RT-LAMP، حيث أن إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx يُنتج الحمض النووي التكميلي (cDNA) أثناء الحضانة متساوية الحرارة عند 65 درجة مئوية. س: ما نوع التنقية الموصى به لبادئات LAMP؟ ج: عند فحص مجموعات متعددة من بادئات LAMP لتحديد تلك ذات الأداء الأمثل لهدف معين، فإن إزالة الأملاح القياسية كافية بشكل عام. ومع ذلك، نوصي بتنقية بادئات FIP وBIP باستخدام PAGE أو HPLC كحد أدنى للاختبار النهائي لضمان دقة النتائج من حيث وقت الكشف والحساسية. س: ما هو LAMP وRT-LAMP؟ ج: تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) هو طريقة تضخيم متساوية الحرارة مصممة للكشف عن الحمض النووي المستهدف دون الحاجة إلى معدات معقدة. يستخدم هذا الأسلوب بوليميراز DNA مُزيح للسلسلة، مثل بوليميراز Bst DNA، و4-6 بادئات تتعرف على 6-8 مناطق متميزة من الحمض النووي المستهدف لإجراء تفاعل تضخيم عالي التخصص. توفر تقنية LAMP حساسية عالية (تصل إلى فيمتوغرام أو أقل من 10 نسخ من الهدف) مع نتائج سريعة: إذ يمكن إتمام التفاعلات في غضون 5-10 دقائق فقط. يمكن إجراء التفاعلات بموارد محدودة، باستخدام حمام مائي للحضانة والكشف عن النتائج بالعين المجردة، أو باستخدام أجهزة قياس فورية وأجهزة عالية الإنتاجية. يتم الكشف عن أهداف الحمض النووي الريبي (RNA) ببساطة عن طريق إضافة إنزيم النسخ العكسي إلى تفاعل LAMP، حيث تُجرى تقنية RT-LAMP كعملية متساوية الحرارة من خطوة واحدة. إن إنزيم النسخ العكسي WarmStart RTx (NEB #M0380) هو بوليميراز DNA موجه للحمض النووي الريبي (RNA) مقترن بأبتامر قابل للارتباط العكسي، مما يثبط نشاط RTx عند درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية، وهو ما يجعله مناسبًا بشكل خاص لتقنية RT-LAMP. لمعرفة المزيد والاطلاع على منتجاتنا من تقنية LAMP، يرجى زيارة صفحة نظرة عامة على تطبيقات LAMP. س: ما هو تركيز صبغة LAMP الفلورية في مزيج LyoPrime WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG)؟ ج: يحتوي مزيج LyoPrime WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (مع UDG) على صبغة LAMP الفلورية (NEB #B1700) بتركيز 0.5X عند تركيز التفاعل النهائي 1X. يمكن الكشف عن الصبغة الفلورية باستخدام قناة SYBR®/FAM في أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الشائعة. س: كيف يُخزن مزيج LyoPrime LAMP؟ ج: في عبوة زجاجية: قبل الاستخدام، يجب تخزين منتجات LyoPrime LAMP في درجة حرارة الغرفة (من 15 إلى 25 درجة مئوية)، بعيدًا عن الضوء (مثلًا، في علبة المنتج الأصلية أو علبة مغلقة أخرى). العبوة الزجاجية والغطاء والسدادة المطاطية غير منفذة للرطوبة، مما يسمح بالتخزين بدون مادة مجففة. التخزين عند -20 درجة مئوية غير ضروري وغير مُوصى به قبل إعادة الترطيب. يمكنك الاطلاع على معلومات إضافية حول التخزين وإعادة الترطيب هنا. صيغة اللوحة: قبل الاستخدام، يجب تخزين مزيج LyoPrime LAMP في درجة حرارة الغرفة (من 15 إلى 25 درجة مئوية) مغلقًا داخل غلافه الأصلي المصنوع من رقائق الألومنيوم. يحمي الغلاف ومادة التجفيف الموجودة بداخله الكاشف المجفف بالتجميد من رطوبة الجو والضوء. يجب إعادة أي أنابيب شريطية غير مستخدمة فورًا إلى الغلاف مع مادة التجفيف، مع إحكام إغلاق السحاب، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. يمكنك الاطلاع على معلومات إضافية حول التخزين وإعادة الترطيب هنا. س: كيف يمكنني إعادة ترطيب مزيج LyoPrime LAMP؟ هل يمكن إعادة تعليقه بتركيز أعلى؟ ج: صيغة القارورة: لإعادة ترطيب المزيج المجفف بالتجميد كمزيج رئيسي 2X، قم بإزالة غطاء القارورة والسدادة، وأضف 675 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز، واخلط لفترة وجيزة باستخدام الماصة أو جهاز الخلط الدوامي اللطيف. يمكن إعادة ترطيب المزيج المجفف بالتجميد حتى 4X لاستيعاب أحجام عينات أكبر. مع ذلك، قد يؤثر إعادة التكوين بتركيزات أعلى من ضعفين سلبًا على وقت الكشف لبعض الأهداف. يُرجى مراجعة البروتوكول لمزيد من المعلومات. صيغة اللوحة: يمكن إعادة ترطيب المزيج المجفف بالتجميد في كل بئر مباشرةً مع البادئات والقالب للحصول على مزيج رئيسي بتركيز 1X (حجم التفاعل 25 ميكرولتر). لذلك، يُوصى بشدة بتحضير مزيج فحص يتضمن البادئات وتوزيعه في كل بئر. بعد إضافة مزيج الفحص، امزجه لفترة وجيزة باستخدام الماصة أو جهاز الخلط الدوامي، ثم أضف القالب. يمكنك الاطلاع على معلومات إعادة الترطيب في صفحة البروتوكول هنا، كما هو موضح في فيديو نظرة عامة على المنتج. س: عند إذابة المنتج المجفف بالتجميد، يبدو المحلول عكرًا في البداية. هل هذا طبيعي؟ ج: نعم، هذا طبيعي. يذوب المنتج المجفف بالتجميد في القارورة فورًا، ولكن خروج الهواء منه يؤدي إلى زيادة مؤقتة في العكارة. سيتخلص المحلول من الهواء بشكل طبيعي خلال 20 ثانية تقريبًا أو بعد الخلط الدوامي اللطيف. في نظام الألواح ذات 96 بئرًا، يؤدي الخلط اللطيف أو استخدام جهاز الخلط الدوامي إلى ذوبان الكعكة فورًا. س: بالنسبة لـ L4401P - هل أحتاج إلى استخدام لوحة LAMP كاملة في تجربة واحدة؟ كيف يتم فصل أنابيب الشرائح ذات 8 آبار؟ ج: تأتي لوحة 96 بئرًا والأغطية البصرية بتصميم قابل للتمزيق، مما يسمح باستخدام اللوحة كاملةً مباشرةً أو جزئيًا. تكون الشرائح الاثنتي عشرة ذات 8 آبار متصلة جزئيًا ببعضها، لذا يمكن فصل العدد المطلوب من أنابيب الشرائح ذات 8 آبار عن طريق تمزيق العدد المطلوب منها برفق. يتم تثبيت شرائح 8 آبار في الإطار الأصفر، ويجب إزالة محول الإطار الأصفر لفصل أنبوب أو أكثر من أنابيب الشرائح. يتم ترقيم شرائح 8 آبار وأغطيتها من 1 إلى 12 في الأسفل لتوفير نظام تتبع مستقل عن محول الإطار الأصفر. يرجى مراجعة قسم معلومات اللوحة وتوافق الجهاز في البروتوكول لمزيد من المعلومات. س: بالنسبة لـ L4401P - كيف أخزن أنابيب الشرائح ذات 8 آبار غير المستخدمة بعد فتح الكيس المعدني؟ ما هي مدة صلاحية أنابيب الشرائح ذات 8 آبار غير المستخدمة؟ ج: يجب إعادة إغلاق أي أنابيب شرائح ذات 8 آبار غير مستخدمة فورًا في الكيس المعدني الأصلي المزود بسحاب مع مادة التجفيف المرفقة، ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة. يُنصح باستخدام هذه الأنابيب في غضون أسبوع واحد من فتح الكيس المعدني للحصول على أفضل النتائج. س: بالنسبة لـ L4401P - ما هي مدة صلاحية الصفيحة أو أنابيب الشرائح ذات 8 آبار خارج الكيس المعدني قبل بدء التفاعل؟ ج: بعد إخراج الصفيحة من الكيس المعدني، يُنصح بترطيب الكاشف المجفف بالتجميد المُعدّ للاستخدام في غضون ساعة واحدة. س: بالنسبة لـ L4401P - ما الغرض من محول الغلاف الأصفر؟ ج: تُقدّم أنابيب الشرائح في محول ذي إطار غلاف أصفر شبه مُغطّى، يُستخدم لمرة واحدة. يحتوي هذا المحول الأصفر على حافة مشطوفة في الزاوية العلوية اليسرى (A1)، مما يُسهّل استخدام المنتج مع أجهزة ABI /Life Technologies® FAST Cyclers والأنظمة الروبوتية. يوفر الإطار الأصفر صلابةً للوحة، لذا يُنصح بشدة باستخدامه لتشغيل اللوحة كاملةً في أجهزة ABI /Life Technologies FAST Cyclers. في حال استخدام اللوحة جزئيًا، يمكن استخدام شرائح فردية ذات 8 آبار مع أو بدون الإطار الأصفر في أجهزة ABI /Life Technologies FAST Cyclers. يتطلب استخدام منصات أجهزة أخرى (مثل Bio-Rad®) إزالة المحول الأصفر قبل بدء دورات التضخيم الحراري. يُرجى مراجعة قسم "معلومات اللوحة وتوافق الأجهزة" في البروتوكول للاطلاع على توصيات استخدام المحول الأصفر في أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الشائعة. سؤال: بالنسبة لـ L4401P - هل يُمكنني إعادة استخدام المحول الأصفر؟ جواب: المحول الأصفر مُصمم للاستخدام لمرة واحدة فقط لمنع التلوث المتبادل بين عمليات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. يجب التخلص منه مع أنابيب الشرائح بعد اكتمال العملية. قد يؤدي فصل الشرائح الفردية عن محول الغلاف الأصفر بعد التضخيم إلى فتح الأغطية بشكل غير مقصود واحتمالية تلوث المُضخَّم. في حال الحاجة إلى محولات إطار غلاف أصفر إضافية، يمكن شراؤها من شركة BIOplastics (رمز المنتج AB19805G). س: بالنسبة لـ L4401P - لماذا توجد صينية كرتونية في العبوة؟ ج: تُضمَّن الصينية الكرتونية في العبوة لدعم اللوحة أثناء الشحن. يمكن إعادة تدويرها عند فتح العبوة، أو يمكن استخدامها كدعامة للوحة أثناء الإعداد في درجة حرارة الغرفة.