نيو إنجلاند بيولابس، M0100S، RNase R

الفئات ذات الصلة : RNases، مواصفات تعديل الحمض النووي الريبي. المواد المطلوبة ولكن غير المرفقة: ماء خالٍ من النيوكلياز (NEB #B1500)، مثبط RNase، فأري (NEB #M0314) (اختياري). تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لتحويل 75 بيكومول من تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة المكون من 20 نيوكليوتيدًا في اتجاه مجرى دبوس الشعر DNA المكون من 38 نيوكليوتيدًا إلى نيوكليوتيدات ريبية قابلة للذوبان في الأحماض في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر في 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل RNase R بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل RNase R بتركيز 1X: 20 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 0.1 ملي مولار MgCl2. محلول التخزين: 300 ملي مولار NaCl، 10 ملي مولار Tris-HCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT (مادة خافضة للتوتر السطحي)، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية. الأسئلة الشائعة : س: هل إنزيم RNase R (NEB #M0100) فعال عند درجات حرارة أخرى غير 37 درجة مئوية؟ ج: نعم، إنزيم RNase R فعال للغاية حتى حوالي 50 درجة مئوية. مع ذلك، قد يؤدي تحضين الحمض النووي الريبي (RNA) عند درجات حرارة عالية إلى تحلل غير مرغوب فيه. ينخفض ​​نشاط إنزيم RNase R عند درجات حرارة أقل من 37 درجة مئوية. س: هل من الضروري تنقية عينات الحمض النووي الريبي قبل هضمها بواسطة إنزيم RNase R (NEB #M0100)؟ ج: نعم، من الضروري تنقية عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) قبل هضمها بواسطة إنزيم RNase R، خاصةً إذا كانت العينة تحتوي على تركيز عالٍ من EDTA. إنزيم RNase R هو إنزيم إكسوريبونوكلياز يعتمد على المغنيسيوم. نوصي بأن تحتوي عينات الحمض النووي الريبوزي على أقل من 0.1 ملي مولار من EDTA قبل معالجتها بإنزيم RNase R. س: ما هو طول الجزء البارز أحادي السلسلة من الحمض النووي الريبوزي (RNA) عند الطرف 3' لكي يرتبط به إنزيم RNase R (NEB #M0100)؟ ج: يفضل إنزيم RNase R الأجزاء البارزة أحادية السلسلة من الحمض النووي الريبوزي (RNA) عند الطرف 3' بطول 10 نيوكليوتيدات على الأقل. تميل الأجزاء البارزة الأطول، مثل ذيول عديد الأدينين (poly(A))، إلى زيادة نشاط إنزيم RNase R. قد لا يرتبط إنزيم RNase R بالأجزاء البارزة الأقصر من 10 نيوكليوتيدات. س: هل يمكن تعطيل إنزيم RNase R (NEB #M0100) بالحرارة؟ ج: نعم، يمكن تعطيل إنزيم RNase R بالحرارة عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. مع ذلك، نوصي بتعطيل إنزيم RNase R بإضافة EDTA (بتركيز نهائي 10 ملي مولار) لمنع التحلل غير المرغوب فيه للحمض النووي الريبي. س: ما هي الحموض النووية الريبية الدائرية؟ ج: الحموض النووية الريبية الدائرية هي حموض نووية ريبية أحادية السلسلة تُشكل حلقة مغلقة تساهميًا. هذه الحموض النووية الريبية مقاومة للإنزيمات الخارجية المُحللة للحمض النووي الريبي، مثل RNase R (NEB #M0100)، لعدم وجود طرف حر ترتبط به هذه الإنزيمات. هذه المقاومة للإنزيمات الخارجية المُحللة للحمض النووي الريبي تجعل الحموض النووية الريبية الدائرية أكثر استقرارًا من نظيراتها الخطية. س: هل لإنزيم RNase R (NEB #M0100) نشاط نجمي؟ ج: نعم، إضافة تركيز عالٍ من إنزيم RNase R إلى عينات الحموض النووية الريبية الدائرية قد يؤدي إلى تحللها. نوصي باستخدام وحدة واحدة من إنزيم NEB RNase R لكل ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (بنسبة 1:1) لمنع النشاط النجمي. س: هل من الممكن هضم الحموض النووية الريبية الخطية المقاومة لإنزيم RNase R (NEB #M0100)؟ ج: نعم، لقد اختبرنا طريقتين لهضم الحمض النووي الريبي الخطي المقاوم لإنزيم RNase R: نوصي بإضافة وحدة واحدة من إنزيم RNase R، ووحدة واحدة من XRN-1 (NEB #M0338)، و5 وحدات من RppH (NEB #M0356) إلى 1 ميكروغرام من عينة الحمض النووي الريبي في محلول تفاعل RNase R بتركيز 1X. يجب حضانة التفاعل لمدة 15 أو 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإزالة الحمض النووي الريبي الخطي بكفاءة. عالج عينات الحمض النووي الريبي مسبقًا باستخدام بوليميراز بولي (أ) من الإشريكية القولونية (NEB #M0276) لإطالة نهايات 3' للحمض النووي الريبي، مما يُحسّن ارتباط إنزيم RNase R ونشاطه. يجب تنقية الحمض النووي الريبي قبل المتابعة بتفاعل RNase R. س: هل يمكن تخزين إنزيم RNase R المخفف في محلول التفاعل بتركيز 1X عند 4 درجات مئوية؟ ج: نعم. تؤكد الاختبارات الوظيفية أن إنزيم RNase R المخفف في محلول تفاعل RNase R 1X لا يُظهر أي فقدان كبير للنشاط لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.