نيو إنجلاند بيولابس، M0201S، كيناز عديد النوكليوتيد T4

الفئات ذات الصلة: وسم الحمض النووي، تطبيقات الكينازات، الفسفرة (كيناز) ، تعريف الوحدة: وحدة واحدة من الإنزيم تحفز فسفرة 20 بيكومول من الأوليغونوكليوتيد الموسوم بالفلورة في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شروط التفاعل: محلول تفاعل كيناز عديد النوكليوتيد T4 بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول تفاعل كيناز عديد النوكليوتيد T4 بتركيز 1X: 70 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار MgCl2، 5 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.6 عند 25 درجة مئوية). تركيز الاستخدام: 10000 وحدة/مل. محلول التخزين: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 0.1 ميكرومولار ATP، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. التعطيل الحراري: 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. الأسئلة الشائعة : س: ما هي العوامل التي يمكن أن تسبب فسفرة غير كاملة عند استخدام كيناز عديد النوكليوتيد T4؟ أ: السبب الأكثر ترجيحًا لعدم اكتمال الفسفرة هو تأكسد DTT في محلول تفاعل كيناز عديد النوكليوتيد T4 (PNK) (يحدث تأكسد DTT بشكل طبيعي ويتسارع بفعل دورات التجميد/الذوبان المتكررة أو التسخين المفرط). استخدم محلولًا جديدًا (أقل من سنة) أو أضف DTT جديدًا بتركيز 5 ملي مولار باستخدام محلول تركيزه 1 مولار. تشمل العوامل الأخرى ما يلي: أ. وجود فائض من أيونات الملح أو الفوسفات أو الأمونيوم: يُثبَّط PNK بوجود مستويات عالية من الملح (تثبيط بنسبة 50% عند تركيز 150 ملي مولار من كلوريد الصوديوم)، والفوسفات (تثبيط بنسبة 50% عند تركيز 7 ملي مولار من الفوسفات)، وأيونات الأمونيوم (تثبيط بنسبة 75% عند تركيز 7 ملي مولار من كبريتات الأمونيوم). يحتوي محلول تفاعل ThermoPol من NEB على 10 ملي مولار من كبريتات الأمونيوم، والتي يجب إزالتها قبل إجراء تفاعل الكيناز. يجب عدم ترسيب الحمض النووي في وجود أيونات الأمونيوم قبل الفسفرة. أ. إزالة الأملاح من العينة عن طريق الغسل بالترشيح أو استخدام عمود طرد مركزي متوفر تجاريًا. ب. وجود شوائب صغيرة من الأحماض النووية في تحضير الحمض النووي: من المهم تنقية الركيزة عن طريق اختيار الحجم لإزالة شوائب الأحماض النووية ذات الوزن الجزيئي المنخفض، والتي قد تمثل نسبة عالية من إجمالي نهايات 5´-OH، حتى لو كانت الكتلة الإجمالية منخفضة. استخدم عمود طرد مركزي متوفر تجاريًا لإزالة هذه الشوائب بالإضافة إلى الأملاح الزائدة. ج. إذا كانت النهاية متراجعة أو غير لاصقة: في حالة كانت النهايات غير لاصقة أو متراجعة من جهة 5´، سخّن خليط الركيزة/المحلول المنظم لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية، ثم برّده بسرعة على الجليد قبل إضافة ATP والإنزيم، ثم حضّنه عند 37 درجة مئوية. يساعد ذلك إنزيم PNK على الوصول إلى نهايات 5´-OH. د. إذا لم يتم تعطيل الفوسفاتاز: لإزالة CIP أو BAP، استخدم الفينول/CHCl3. يمكن تعطيل إنزيمات Quick CIP، وAntarctic Phosphatase، وrSAP بالحرارة. هـ. عدم إضافة ATP: يتطلب إنزيم PNK وجود ATP للنشاط. عادةً ما تتبع تفاعلات PNK تفاعلات ربط. ولتبسيط هذه العملية، تم تحسين PNK للاستخدام في محلول تفاعل T4 Ligase (الذي يحتوي على الكمية المناسبة من ATP). نوصي بإجراء تفاعل PNK في محلول Ligase لمدة 30 دقيقة؛ يمكنك بعد ذلك المتابعة إلى الربط دون تغيير المحلول أو التعطيل بالحرارة؛ ومع ذلك، سيظل PNK نشطًا في التفاعل اللاحق ما لم يتم تعطيله بالحرارة أو إزالته (عمود الطرد المركزي، تنقية الجل) قبل الخطوة التالية. س: هل يمكنني استخدام T4 Polynucleotide Kinase وT4 DNA Ligase في نفس محلول التفاعل؟ ج: نعم، بالنسبة للفسفرة غير المشعة، ولكن ليس لتفاعلات الوسم الإشعاعي لأن ATP غير المشع في محلول T4 Ligase سيتداخل مع الوسم. س: كيف يمكن تحسين معدل الفسفرة عند استخدام إنزيم T4 بولينوكليوتيد كيناز؟ ج: أ. عند العمل مع نهايات 5' متراجعة، سخّن مزيج التفاعل لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية، ثم برّده بسرعة على الجليد قبل إضافة الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (أو محلول منظم لليغاز يحتوي على الأدينوسين ثلاثي الفوسفات) والإنزيم، ثم حضّنه عند 37 درجة مئوية. ب. أضف بولي إيثيلين جلايكول (PEG) إلى التفاعل. يمكن أن تؤدي إضافة بولي إيثيلين جلايكول 8000 بتركيز نهائي 5% (وزن/حجم) إلى تحسين النتائج. ج. أضف سبيرميدين. سيعزز السبيرميدين التفاعلات بنسبة 20-30% تقريبًا، ولكنه لا يُستخدم في تحديد الوحدة وليس ضروريًا للنشاط الكامل. د. استخدم محلولًا منظمًا بديلًا لتفاعل التبادل. يمكن تحقيق مستويات أعلى من الإدماج في تفاعل التبادل باستخدام محلول منظم يحتوي على 50 ملي مول من إيميدازول-كلوريد (الأس الهيدروجيني 6.4)، و10 ملي مول من كلوريد المغنيسيوم، و5 ملي مول من ثنائي ثيوثريتول (سامبروك وآخرون، 1989، الاستنساخ الجزيئي، الطبعة الثانية، الصفحات 10.59-10.67، 11.31-11.33، مختبر كولد سبرينغ هاربور، كولد سبرينغ هاربور). هذا المحلول المنظم غير متوفر لدى شركة NEB. س: هل أحتاج إلى إزالة الفوسفات قبل الوسم؟ ج: ليس بالضرورة. يعطي تفاعل التبادل نتائج مقبولة، ولكن إزالة الفوسفات أولاً، متبوعةً بالتفاعل الأمامي، تعطي أفضل إدماج. س: ما مقدار الركيزة التي يمكن فسفرتها في تفاعل قياسي؟ ج: حتى 350 بيكومول من النهايات 5' للفسفرة الباردة، وحتى 50 بيكومول للفسفرة الساخنة. ملاحظة: 1 ميكروغرام من 20 وحدة = 150 بيكومول من النهايات 5'. مثال: لحساب عدد البيكومولات في 1 ميكروغرام من 30 وحدة: 150 بيكومول × (20 وحدة / 30 وحدة) = 100 بيكومول. س: كم وحدة من إنزيم T4 بولينوكليوتيد كيناز يجب استخدامها لتفاعل نموذجي؟ ج: عادةً، 10 وحدات للتفاعل البارد و20 وحدة لتفاعل الوسم الساخن. بما أن تركيز الركيزة وتركيز ATP أقل من قيمة Km في التفاعل الساخن، يلزم استخدام وحدات أكثر. يتم تحديد الوحدات في ظل ظروف مثالية حيث يكون تركيز الركيزة وATP أعلى من قيمة Km الخاصة بهما. س: كيف يمكنني تعطيل الإنزيم؟ ج: يؤدي الحضانة لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية إلى تعطيل إنزيم T4 بولينوكليوتيد كيناز تمامًا. س: كيف يتم حساب مولارية النهايات؟ أ: تقترح NEB استخدام أداة NEBioCalculator المجانية عبر الإنترنت. ستحسب هذه الأداة تركيز المواد العضوية بالإضافة إلى حسابات رياضية حيوية أخرى. إذا كنت ترغب في الحساب يدويًا، فيرجى ملاحظة ما يلي: المولارية = [(ميكروغرام/ميكرولتر) ÷ (أزواج القواعد × 650 دالتون)] × 2 الأطراف مثال: احسب مولارية الأطراف لناقل خطي بطول 5 كيلوبايت بتركيز 250 نانوغرام/ميكرولتر: [(0.25 ميكروغرام/ميكرولتر) ÷ (5000 × 650 دالتون)] × 2 = 154 نانومولار احسب مولارية الأطراف إذا وضعت 50 نانوغرام من هذا الناقل في تفاعل ربط حجمه 20 ميكرولتر: 50 نانوغرام ÷ 20 ميكرولتر = 0.0025 ميكروغرام/ميكرولتر [(0.0025 ميكروغرام/ميكرولتر) ÷ (5000 × 650)] × 2 = 1.54 نانومولار حدد كمية يلزم إدخال 1 كيلوبايت لتحقيق نسبة 3:1 بين الإدخال والناقل: 3 × 1.54 نانومولار = 4.62 نانومولار [(X ميكروغرام/ميكرولتر) ÷ (1000 × 650)] × 2 = 4.62 نانومولار، 0.0015 ميكروغرام/ميكرولتر × 20 ميكرولتر = 0.03 ميكروغرام = 30 نانوغرام. هل يقع هذا التفاعل ضمن النطاق الأمثل من 1 إلى 10 ميكروغرام/مل؟ (50 نانوغرام ناقل + 30 نانوغرام إدخال) ÷ 20 ميكرولتر = 4 ميكروغرام/مل. س: ما هي العلامات التي يمكن استخدامها؟ ج: الفسفرة باستخدام 32P-ATP أو 33P-ATP (لا يعمل 35S كواهب). نظرًا لانخفاض انبعاثات الطاقة لـ 33P-ATP، يجب تعريض الأفلام لفترات طويلة. تُعدّ قياسات الوميض فعّالة مع 33P-ATP. س: هل يعمل إنزيم T4 بولينوكليوتيد كيناز في محلول rCutSmart؟ ج: نعم، يعمل إنزيم T4 بولينوكليوتيد كيناز في محلول rCutSmart، مع إضافة ATP وDTT. لمعرفة نسبة نشاطه الوظيفي في rCutSmart، ونسبة نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي الأخرى في عملية الاستنساخ، يُرجى الرجوع إلى مخطط نشاط إنزيمات تعديل الحمض النووي في محلول rCutSmart®.